Abstract
Bei der Geburt erfährt der Lunge einen tiefen phänotypischen Wechsel von Sekretion der Absorption, die unabhängig voneinander auf die Atmung zur Anpassung ermöglicht. Die Förderung und diesen Phänotyp aufrechtzuerhalten ist von entscheidender Bedeutung in der normalen alveolären Wachstum und Gasaustausch während des gesamten Lebens. Mehrere in vitro - Studien haben die Rolle der wichtigsten Regulationsproteine gekennzeichnet, Signalmoleküle und Steroidhormone, die die Rate der Lungenflüssigkeit Clearance beeinflussen. Allerdings müssen in vivo Untersuchungen durchgeführt werden , um zu ermitteln , ob diese regulatorischen Faktoren wichtige physiologische Rolle bei der Regulierung der perinatalen Lungenflüssigkeitsaufnahme spielen. Als solches stellt die Nutzung von Echtzeit-Röntgenbildgebung perinatale Lungenflüssigkeit Clearance oder Lungenödem, um zu bestimmen, einen technologischen Fortschritt auf dem Gebiet. Wir berichten hier über erläutern und einen Ansatz illustrieren die Rate der alveoläre Lungenflüssigkeit Clearance und alveolar Überschwemmungen in C57BL / 6-Mäuse an postnatalen Tag 10 uns zu beurteilenRöntgenbildgebungs und Analyse ing. Die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls bedarf der vorherigen Zustimmung von institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschüsse (IACUC), einem in - vivo - Kleintier - Röntgen-Bildgebungssystem und kompatible molekulare Bildgebung Software.
Introduction
Bei der Geburt muss das Neugeborene Lunge Übergang von einer Flüssigkeit absondernden zu einem Fluid resorbierbaren Organ ausreichende Belüftung und Sauerstoffversorgung des Körpers zu schaffen. Die Mechanismen, die (oder behindert) wirksame Clearance von Lungenflüssigkeit bei der Geburt erleichtern bleiben unklar. Die Modellierung der Rate von Alveolarflüssigkeit Clearance in C57BL / 6 neugeborenen Maus Welpen werden zu einem besseren Verständnis der regulatorischen Faktoren führen, dass die Rate der Flüssigkeitsaufnahme erhöhen oder abschwächen können. Es könnte auch auf andere neonatal Modellen der akuten Lungenschädigung oder Infektionen angewendet werden und zu neuen therapeutischen Strategien für Neugeborene mit Atemnot führen könnte.
Da Neugeborene Lungen winzig im Vergleich zu erwachsenen Lungen sind, herkömmliche Maßnahmen von Alveolarflüssigkeit Clearance, die auf Lavage oder gravimetrische Messungen beruhen möglicherweise nicht geeignet genau in Neugeborenen Lungen Modelle Lungenflüssigkeit Clearance zu studieren. In diesem Protokoll zeigen wir einen Assay, der für ermöglichtdie genaue Bestimmung der Alveolarflüssigkeit Clearance-Raten in 10 postnatalen Tag C57BL / 6-Maus Welpen ein kleines Tier Imager. Ein großer Vorteil eines fluoroskopischen Ansatz der Verwendung ist , dass die Tiere in vivo abgebildet werden. Sie sind frei zu atmen und kann von dieser minimal-invasiven Test für die künftige Beobachtung und Untersuchung erholen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, Lungenödem bei Neugeborenen Lunge zu modellieren, und die Rate der Alveolarflüssigkeit Clearance bei Neugeborenen Lungen bewerten. Diese Technik wurde entwickelt, teilweise als eine Strategie zur Verringerung der Zahl der Tiere erforderlich zu verringern, noch experimentelle Ausgang zu maximieren. Diese Technik ermöglicht auch eine bessere Erkennung von Lungenflüssigkeitsvolumen Röntgenbildgebung mit und erfordert Kenntnisse in grundlegenden Tierzurückhaltung und Handhabung 1; Kleintierarztpraxen und tracheale Instillation 2, ein kleines Tier - Imager und grundlegende Bildanalyse - Software. Die Ermittler , die wünschen Lungenflüssigkeitsvolumen in vivo zu bewerten (frei breathing narkotisierten Tier-Modelle) können Sie dieses Verfahren für ihre Anwendung finden. Schließlich könnte dieses Protokoll andere bestehende Modelle von Neugeborenen in der mechanistischen Untersuchung der bronchopulmonalen Dysplasie verwendet Lungenverletzung zu ergänzen, einschließlich Hyperoxie-induzierten Lungenverletzung, mechanische Belüftung und Modelle von Lungenentzündung 3.
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Protocol
Alle experimentellen Techniken müssen in Einklang mit den institutionellen Pflege und Verwendung Ausschuss Richtlinien durchgeführt werden.
1. Röntgen Imaging Acquisition
- Software - Übersicht (siehe Abbildung 1 für eine Übersicht über die Software - Einstellungen).
- Wählen Sie die Aufnahmetaste direkt unter der Registerkarte Datei.
- Im Einstellungen Dropdown-Menü wählen Sie aktuelle Sitzung.
- Wählen Sie Standard - Exposure in Dropdown-Feld unter Belichtungszeit befindet.
- Stellen Sie die Belichtungszeit auf 2,00 min und Nr Exposures zu 1. Stellen Sie die X - Binning und Y Binning auf 2 Pixel. Siehe Abbildung 1.
- Endgültige Accumulation Wählen Sie aus dem Exportoptionen im Dropdown-Menü.
- In den Beleuchtungseinstellungen, select Röntgen von der Beleuchtungsquelle im Dropdown-Menü. Der Standard KVP wird bei 35 gesetzt.
- Wählen Sie Automatische Auswahl in der Apply - Referenzdatei im Dropdown-Menü die entsprechende Röntgenreferenzdatei anzuwenden. (Siehe Abschnitt 2).
- Im Set Kamera Um die Einstellungen, stellen Sie die f-stop auf 2,51.
- Stellen Sie die FOV (Field of View) zu 125,64 für PN10 Mäuse.
- Stellen Sie die Focal Plane bis 13 und in der Drop-Down - Menü neben dem Focal Plane Schieberegler, wählen Sie X-Ray.
- Für Röntgenstrahlen, stellen Sie den Anregungsfilter und den Emissionsfilter auf 0 in der Drop-Down - Menü.
- Speichern der aktuellen Sitzung von New Klick auf die oben neben Einstellungen. Geben Sie den Namen für die neue Einstellungen abrufen Datei, zB "Jove Einmalige Exposition Ereignis für ein Protokoll zu machen." Siehe Abbildung 2.
- Erstellen eines X-ray Imaging Protocol
- Klicken Sie auf das Erstellen / Bearbeiten Protokolle Schaltfläche auf der rechten Seite des geöffneten Fensters.
- Als neues Protokoll Pop-up - Fenster erscheint, klicken Sie auf die Schaltfläche Neu in der oberen rechten Ecke
- Geben Sie den Namen ein , das Protokoll unter speichern wird, zum Beispiel "Jove Demo - Protokoll", und klicken Sie auf OK. (Siehe Abbildung 3).
- Auf der Unterseite des Protokolls Pop-up - Fenster in Protokollschritte, stellen Sie sicher , dass Schritt 1 im roten Text markiert ist, erfassen Neue Bilder ausgewählt wird, und nichts tun ist in der Vor Bildaufnahme im Dropdown - Menü ausgewählt.
- Im Aufnahmeeinstellung, wählen Sie die vor kurzem generierte einmalige Exposition Ereignis aus Schritt 1.1.12.
- Wählen Sie Wait (s) aus dem nach der Bildaufnahme Dropdown-Menü.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Bearbeiten, type 180 in das Pop-up - Fenster, und klicken Sie auf OK eine 3 min Wartezeit nach jedem 2 min Erwerb hinzuzufügen.
- Duplizieren Schritt 1 von rechts , um den Schritt 1 Tab klicken und Duplizieren Schritt auswählen. Erstellen 23 Duplikate für eine 2 Stunden Beobachtungszeitraum. (Siehe Abbildung 4).
- Im letzten Schritt (Schritt 24), die After - Image ändern Capture - Einstellung nichts zu tun von Wait (sec).
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern und beenden Sie den Protokolleditor.
2. Beleuchtung Referenzdateien
Hinweis: X-ray Beleuchtung Referenzdateien auf ein Röntgenbild, um automatisch zu korrigieren, um Schwankungen in der Detektor Gleichförmigkeit der Röntgenbilder im gesamten Experiment erhalten Nehmen. Die unten beschriebenen Verfahren sind spezifisch für die Bruker in vivo Tier Imaging Systems; andere in vivo - Bildgebungssysteme könnenverwendet werden.
- Generieren Sie eine Beleuchtungsreferenzdatei durch die molekulare Imaging - Software zu öffnen , und klicken Sie auf die Schaltfläche Capture.
- Mit dem Pop-up - Menü, stellen die Röntgenaufnahmeeinstellungen in , Lichtquelle (siehe vorgeschlagenen Einstellungen in Abschnitt 1 oben) und wählen Sie dann Illumination Referenz in der Belichtungstyp. Dies kann gefunden werden unter den Standard-Exposures Dropdown-Feld. (Siehe Abbildung 5).
- Entfernen Sie alle Proben aus dem Bild entfernt. Stellen Sie die X- und Y-Binning bis 4 x 4 Binning. Siehe Tabelle 1: Beleuchtung Referenzdatei Belichtungszeiten die genaue Belichtungszeit zu bestimmen.
- Drücken Sie Expose.
- Tragen Sie die Referenzdatei durch die Auswahl von Auto Wählen Sie aus der Drop - Down - Menü unter Referenz - Datei. (Siehe Abbildung 6). Die Beleuchtung Referenzdatei wird nun automatisch an alle X-ray im angewendet werdenAlter mit den gleichen Kameraeinstellungen erfasst. Schritte 2,1-2,4 wird nicht wiederholt werden müssen, wenn dieselbe Kameraeinstellungen in nachfolgenden Experimenten verwendet werden.
Hinweis: Eine Beleuchtungsreferenzdatei kann nach der Bildaufnahme angewendet werden, oder wenn eine Fehlermeldung auftritt, nachdem die automatische Auswahl von Referenzdateien. Bewerben Beleuchtung Referenzdateien nach der Bildaufnahme die folgende Reihe von Befehlen in der Navigationsleiste der molekularen Bildgebung Software: Bild> Bild Math> Typ: Aufgabe> berechnen: Beleuchtung Korrektur. Wählen Sie das Eingangsbild (X), die Sie möchten die Beleuchtung Referenzdatei (Y) zu beantragen. Benennen Sie die korrigierte Datei (Z). (Siehe Abbildung 7).
3. Tierbehandlung
- Der Erwerb Tiere
- Erwerben Sie schwanger Dämme von kommerziellen Züchtern oder züchten weibliche Mäuse im Haus bei 12 Wochen alt (oder älter) in Einklang mit den institutionellen Richtlinies.
- Haus neugeborenen Mäusen mit laktierenden Müttern bis zum Tag nach der Geburt (PN) 10.
- Tier Anesthesia (PN 10)
- Bereiten Sie eine Ketamin / Xylazin Cocktail PN 10 Mäuse für längere betäubend bis 40 min Dauer von bis zu betäuben. Hinzufügen 500 ul Ketamin (100 mg / ml) auf 75 & mgr; l Xylazin (100 mg / ml). Verdünnte 1:10 in einer 0,9% igen Kochsalzlösung mit einer Ketamin (100 mg / kg) / Xylazin (10 mg / kg) Anästhetikum-Cocktail zu machen.
- Wiegen Sie die neugeborenen Mäusen.
- Verwendung einer 3/10 Spritze mit einer 31 G 5/16 Zoll (8 mm) Nadel verabreichen 10 ul / g Körpergewicht der Anästhesie mit einer intraperitonealen Injektion.
- Halten Sie Tiere trocken und isoliert, um übermäßigen Verlust von Körperwärme zu verhindern.
4. Trachea Instillationen
- Vorbereiten eines intratracheal Kochsalzlösung bestehend aus 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 und 10 mM HEPES; pH = 7,4. Die Osmolalität dieser Lösung sollte319 mosmol / kg H 2 O.
- Berg narkotisierten Tiere Bauchseite nach oben auf eine geneigte chirurgische Board mit chirurgischen Band. Ensurethat der Tiere Köpfe sind an der Spitze der Schräge.
- Führen Sie eine Zehe Prise, um sicherzustellen, dass die Tiere für die Chirurgie narkotisierten und bereit sind. Desinfizieren Sie alle chirurgischen Bereiche, Instrumente und Thoraxbereich des Tieres.
- Machen Sie einen kleinen (3 mm) Einschnitt in der anterior-medialen ventralen Seite des Halses (Halsbereich) mit einem chirurgischen Skalpell, Größe 11. beiseite schieben die platysma und vorderen trachealen Muskeln mit stumpfer Zange, um die Luftröhre zu visualisieren und zu öffnen.
- Instill 3 & mgr; l / g Gewicht (ungefähr 10 bis 30 & mgr; l Endvolumen) Kochsalzlösung über die Luftröhre freigelegt unter Verwendung einer 31 G 5/16 Zoll (8 mm) Nadel. Die kleine Schnitt wird während Tierbildgebung offen gelassen und in der Regel heilt sich selbst gut. Beraten Sie sich mit lokalen Abteilung für Tier Ressource zu bestimmen, ob der Schnitt ebenfalls offen gelassen werden kann. Andernfalls Nähte könnenerforderlich.
5. Tier Imaging
- Positionieren Sie die Welpen ventral auf einem klaren Boden, abnehmbar, Tierbildgebung Fach. Center, um die Tiere, so dass der Röntgenstrahl direkt über den Brustbereich sein wird.
- Für ungerade nummerierten Tier Kohorten, legen Sie den ersten Welpen direkt in der Mitte der Schale, und gerade numerierten Kohorten die erste Welpe gerade links von der Mitte platzieren, so dass, wenn die anderen Tiere auf dem Tablett alle Tiere platziert sind zentriert sind.
- Bringen Sie die Imaging-Tablett auf den Röntgenbild Schrank und schließen Sie die Schranktür.
- Schalten Sie das Tier thermische Steuereinheit die narkotisierten Tiere Körpertemperatur zu halten. Verwenden, um die hohe Einstellung eine Kammertemperatur von ungefähr 35 zu erreichen - 37 ° C. Schalten Sie Tiernarkosegerät (verdampfte Isofluran über Sauerstoff geliefert) Tiere zu gewährleisten, werden betäubt und im gesamten Dauer von 2 Stunden Bildgebungsverfahren immobilisiert.
- Ausführen von X-ray Imaging-Protokoll
- Klicken Sie auf Sammeln , und wählen Sie das entsprechende Protokoll, zB "Jove Demo - Protokoll" aus dem Protokoll im Dropdown-Menü. (Siehe Abbildung 8).
- Klicken Sie auf das ausgewählte Protokoll - Taste auf der molekularen Imaging - Software ausführen.
Hinweis: Ein Pop-up-Fenster wird der Status der Bildaufnahme zu verfolgen, wenn das Protokoll das Fenster vollständig verschwinden. Die Röntgendosis niedrig ist, <als 0,3 mRem oder etwa 10 mal kleiner als eine dentale Röntgen. Wie bei anderen Verfahren, X-Ray, gibt es kein Reststrahlung. - Wenn die 2 Stunden Erwerb Sitzung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Tiere aus dem Imaging-Fach und bringt sie in ihren Käfig. Überwachen Tiere zur vollständigen Wiederherstellung, bevor Racks zurück.
6. Datenanalyse
Hinweis: Molecular Imaging-Software ermöglicht die Quantifizierung und die Übersetzung von Xray Pixelintensität in Rate von Lungenflüssigkeit Clearance. Die folgenden Schritte beschreiben benötigt die Verfahren von Röntgenbildern zu normalisieren und Intensitäten in definierten Regionen von Interesse (ROI) zu quantifizieren.
- Entwerfen Sie einen ROI - Vorlage
Hinweis: Ein Bereich von Interesse Vorlage muss während der 2 Stunden Studie spezifisch für den aufgenommenen Röntgenbilder erstellt werden und sollte verwendet werden, um Röntgenintensitäten unter experimentellen Gruppen zu vergleichen. Da kleine Mengen von Salz Herausforderungen typischerweise in der linken oberen Lappen der Lunge anreichern 4-6, sollte der ROI (s) auf diesem Teil der Lunge konzentrieren.- Öffnen Sie die erste und die letzte Röntgenbild in der 2 Stunden gesetzt. Wählen Sie das Fenster des ersten Röntgenbildes.
- In der Navigationsleiste, wählen Sie Manuell-ROIs> New ROI Set.
- Klicken Sie auf ROI Ellipse und einen ROI erstellen , die angemessen auf der linken lung.An ROI Maus deckt nicht , bis die rote definiert, skizzierte ROI ist dragged in eine andere Position. Eine definierte ROI wird in blau mit einer Reihe skizziert werden.
- Wenn mehrere Welpen abgebildet sind, klicken Sie auf den roten, skizzierte ROI und ziehen, um die linke Lunge der anderen Mäuse zu individuelleren ROIs im gleichen Satz erstellen. Ziehen Sie den roten, skizzierte ROI zu einem Bereich mit einem klaren Hintergrund einen Hintergrund ROI zu erstellen.
- Pointer Auswahl Wählen Sie die ROIs auf Position über jeder Maus der linken Lunge zu liegen, befindet sich direkt unter der zweiten Rippe.
- In der oberen Symbolleiste auf Bildanzeige.
- Überprüfen Sie Overlay in der Bildanzeige - Dialog die letzte Röntgenbild zu überlagern , während die eingestellten ROI Standorte beibehalten wird . Wählen Sie bei Bedarf Pointer Auswahl in der Navigationsleiste , die Positionen der ROIs anzupassen und in beiden Bildern eine ausreichende Lungen Abdeckung zu gewährleisten.
- Im manuellen ROI Dialog wählen Sie Template> Speichern auf Vorlage. Name ter-Vorlage und klicken Sie auf OK.
- Schließen Sie beide Bilder. Wählen Sie Nein , wenn Sie dazu aufgefordert Änderungen zu speichern.
- Tragen Sie die ROI-Vorlage jedes Röntgenbild erfasst Fluid-Clearance zu analysieren, indem alle Bilder Öffnen während der Studie genommen. Beginnen Sie mit einer offenen Datei auswählen und klicken Sie auf Manuell ROIs> Vorlage.
- Wählen Sie die zuvor erstellte ROI-Vorlage aus dem Dropdown-Menü aus und klicken Sie auf alle geöffneten Dokumente anwenden.
- Export Numerische ROI Daten der Bilder in ein Tabellenkalkulations
- In der linken oberen Ecke klicken Sie auf Datei> Exportieren von Daten> ROI.
- Überprüfen Sie wie angezeigt und Auto Open in Excel in dem Pop-up - Dialog.
- Wählen Sie Export alle geöffneten Dokumente.
- Benennen Sie die Datei und klicken Sie auf Speichern.
- Schließen molekularen Imaging-Software.
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Representative Results
Die linke Felder in den Figuren 9 - 10 sind von PN 10 Mauslungen zu Beginn der Studie abgebildet (pre-eingeflößt). Diese Bilder zeigen erfolgreiche Einträufeln von Salz Herausforderungen in den linken Lappen der Neugeborenen-Lungen. In 9 wurde die Mauslunge tracheal mit der Salzlösung , die oben definiert eingeflößt (siehe Abschnitt 2.1). Die mittlere und rechte Bilder von Figur 9 sind Röntgenbilder aus derselben Maus 5 erhaltenen min und 2 h nach Instillation; Dieses Tier hatte erfolgreich die Salz Herausforderung gelöscht. Insbesondere erhöhte sich die Röntgenstrahlintensität von dieser Tiere ROI von 187,67 bis 515. Somit besteht eine umgekehrte Korrelation zwischen Pixelvolumendichte und Lungenflüssigkeit; das heißt, je größer der relative Wert ist, desto weniger Flüssigkeit gibt es in der Lunge. Es kann hilfreich sein , zu verstehen , dass mehr Röntgenenergie (also einen größeren wiesener Wert) absorbiert wird , wenn es weniger Flüssigkeit attenuati istng die X-ray. In 10 wurde die PN 10 Mauslunge tracheal mit einer Verbindung eingeflößt oxidiertem Glutathion enthält (in Kochsalzlösung unter 2.1 beschrieben auflösen) , die Alveolarflüssigkeit Clearance der Salz Herausforderung durch die Blockierung epithelialen Natriumkanals Aktivität gehemmt; der numerische Wert dieses ROI des Tieres aus der pre-Instill und post-eingeträufelt Röntgen abzubildenden Dateien, indikativ für zunehmende Röntgenopazität verringern. Insbesondere die Nettointensität des Tieres ca. 5 min nach dem Einträufeln war - 64 und verringerte sich auf - 182. Auch hier ist zu beachten, die inverse Beziehung zwischen der ROI Pixelintensität und der Menge der Flüssigkeit in der Lunge; erhöhte Fluid in der oberen linken Lappen der Lunge dämpft Röntgenabsorption.
Auswertung der Nettointensität des ROI ermöglicht eine quantitative Auswertung von Änderungen in der Rate der Lungenflüssigkeit Clearance, wenn auch Erfassungs-Software ermöglicht auch die Ermittler zum Ausdruck bringenDaten in Form von g / cm 3 , wenn gewünscht. Darüber hinaus können die Forscher jedes Tier als seine eigene Kontrolle verwenden und alle Röntgenintensitäten zu einem Anfangszeitpunkt (Io), wie zum Beispiel t = 5 min und berichten Nettoänderungen in Röntgenopazität (dh ein Maß für die Änderung normalisieren in Lungenflüssigkeitsvolumen).
Abbildung 1. Belichtungseinstellungen. Dieser Screenshot zeigt die entsprechenden Einstellungen Belichtung in diesem Protokoll verwendet. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Einstellungen Datei. Dieser Screenshot zeigt einen wichtigen Schritt in eine Datei Einstellung zu erzeugen, die verwendet werdenin einem Protokoll. Ein Pop - up - Fenster (siehe Abbildung) werden für den Erwerb Einstellungen Datei einen neuen Namen anfordern. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Imaging - Protokoll. Dieser Screenshot zeigt einen wichtigen Schritt bei der Bestimmung, ob ein neues Bildgebungsprotokoll erfolgreich erstellt wurde. Ein Pop - up - Fenster (siehe Abbildung) erscheint und eine neue Protokollname wird für das erzeugte Protokoll angefordert werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. ProtOcol Schritte. Dieser Screenshot zeigt eine Verknüpfung eine Akquisitionseinstellungsdatei zu kopieren, legen Sie einen neuen Schritt, oder ein Schritt innerhalb eines Bildgebungsprotokoll zu löschen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Beleuchtung Referenz. Dieser Screenshot der Beleuchtung Referenzbefehl und die entsprechenden Einstellungen in der Tierbildgebung geeignete Software für die Erstellung eines Beleuchtungsreferenzdatei zeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. Auto Select Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Lichtkorrektur. Dieser Screenshot zeigt die entsprechende Anwendung einer Beleuchtungsreferenzdatei nach Tierbildgebung erzeugt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8. Führen Sie Protokoll. Dieser Screenshotzeigt , wie ein ausgewähltes Protokoll auszuführen. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 9. Röntgenbilder geräumte Lunge Repräsentative Bild von PN 10 Lungen vor der Aufnahme einer Salz Herausforderung dar. (Pre-einzuflößen; linken Fensterbereich); 5 min nach dem Einträufeln (Mitte), und 2 h nach der Salz Herausforderung aus der ansonsten gesunden Lunge (rechtes Bild) verzogen hatte. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figure 10. Röntgenbilder von Flooded Lungs. Vertresentativen Bild von PN 10 Lunge vor einer Salz Herausforderung zu empfangen (pre-einzuflößen; linke Platte), die Glutathion-Disulfid, das den Transport parazellulär gelösten Stoff hemmt; 5 min nach dem Einträufeln von Glutathion - Disulfid (Mitte), und 2 h nach der parazellulären Transport Hemmung, die alveoläre Überflutung führt (rechtes Bild). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.Kein Filter = 10 sec Belichtungs 0.1mm = 15 sec Belichtungs 0.2mm = 20 sec Belichtungs 0.4mm = 30 sec Belichtungs 0.8mm = 30 sec Belichtungs Die Größe des Röntgenfilters entspricht einer bestimmten Belichtungszeit für creine Beleuchtungsreferenzdatei zu essen. Tabelle 1 Illumination Referenzdatei. Diese Datei meldet die entsprechenden Belichtungszeiten zur Erzeugung von Beleuchtungsreferenzdateien basierend auf Röntgenfilter in der Bildgebung verwendet.
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Discussion
Mit Hilfe der Röntgenbildgebung, können klare Bilder der Neugeborenen-Lungen für Lungenflüssigkeitsvolumen analysiert werden. Wir 7,3,11 und andere 10 haben erfolgreich Röntgenbildgebung zu bestimmen , dynamische Veränderungen der Lungenflüssigkeitsvolumen in frei atmende narkotisiert Tiermodellen, und diese Technik ist sehr vielversprechend voran die Untersuchung der Neugeborenen Lungenverletzung verwendet. Ein großer Vorteil unseres Ansatzes im Umgang mit Lungenflüssigkeitsvolumen zu bewerten (im Gegensatz zu Röntgen Phase constrast 10 zum Beispiel) ist , dass bis zu fünf PN10 Maus Welpen können gleichzeitig ein Abbildungssystem untersucht werden , verwenden , das ist üblich , in Forschungseinrichtungen und Kerne .
eine entsprechende Lungenflüssigkeitsvolumen einflößen, um nicht in die Lunge ertrinken oder kollabieren, ist entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls und müssen experimentell vor Protokolle Röntgenbildgebung untersucht werden können angewendet werden. Die Empfindlichkeit dieses Assay ermöglicht die Detektion von sehr kleinen Volumes von eingeflößt Salz über Röntgendetektion. Wir konnten Unterschiede in der Röntgenopazität der neonatalen Lungen mit 10 & mgr; l Volumina von Salzlösung eingeflößt zu erkennen. Der Unterschied in der Röntgentrübungen sind noch ausgeprägter, wenn Natriumkanal-Inhibitoren in den alveolaren Luftraum eingebracht werden, da die Salz Herausforderungen nicht absorbiert werden kann, und die Lungen weiter Fluid in den Luftraum zu sezernieren. In dem Fall, dass ein unangemessen hohes Volumen an Kochsalzlösung eingeführt wird, Tiere in die Abbildungskammer mit Sauerstoff strömt in die Kammer über die Anästhesie Ports Platzierung kann die Atmung in überfluteten Lunge erleichtern.
Unsere Ergebnisse Röntgenbildgebung unter Verwendung von vergleichbar Alveolarflüssigkeit Abstände gemessen herkömmlicheren Ansätzen, wie beispielsweise Lungen wet-zu-Trocken - Gewichtsverhältnisse und Evans Blau zur Bestimmung der Proteinkonzentration 4. Wir zeigen nun, dass dieser Ansatz auf der Neugeborenen-Maus pup angewendet werden. Diese Röntgen imAging-Technik Lungenflüssigkeitsvolumen zur Bestimmung kann leicht mit zusätzlichen Bildgebungsverfahren kombiniert werden. Zum Beispiel können fluoreszierende Marker oder Biolumineszenz-Sonden gleichzeitig in die Alveolen und bewertet eingeflößt werden. (Nachweis von fluoreszierenden und Lumineszenzsonden wurde 8 beschrieben, und sprengt den Rahmen dieses Berichts). Die Fähigkeit, das Volumen der Lungenflüssigkeit zusammenRegister (X-ray-Bildgebung) neben der Fähigkeit, fluoreszierenden Biomarker zu erkennen ist eine von mehreren Vorteilen dieses dynamischen Test unter Verwendung von und das kommerzielle System zur Messung der Lungenflüssigkeit Clearance. Weitere Vorteile dieser Ansatz der Verwendung für die Abfertigung und die relative Lungenflüssigkeitsvolumen Bestimmung beinhaltet die Fähigkeit, Langzeitstudien durchzuführen (also die Anzahl der Tiere benötigt Abnahme statistisch signifikanten Beobachtungen zu erreichen), und die Fähigkeit, in frei kleine Veränderungen der Lungenflüssigkeitsvolumen zu erfassen, die Atmung , anästhesiert, Neugeborenen Maus Welpen. Eine Einschränkung der Verwendung einjedoch in vivo Bildgebung Ansatz ist, dass die Anästhesie , die Verteilung von Gas und die Durchblutung in der Lunge verändern kann. Mismatches in Ventilation und Perfusion (V / Q) und Rangieren wurden unter Anästhesie in Freiwilligen gesunden Erwachsenen 12, so dass die Sauerstoffversorgung des Körpers gezeigt zu erhöhen reduzieren. Dieser nachteilige Effekt kann jedoch durch eine Erhöhung der eingeatmeten Sauerstoffkonzentration kompensiert werden. Aus technischer Sicht Variabilität zwischen den Abbildungssystemen in Röntgenfluss Energie kann Optimierung jedes System vor der Durchführung bildgebenden Untersuchungen erfordern. Beispielsweise auf einem System mit einer Röntgenquelle mit Flußmittel und / oder ein Detektor mit überlegenen Quantenwirkungsgrad, eine höhere f / Stopp und unteren binning Zustand könnte eine bessere Bildqualität liefern, wenn kleine Änderung in der Röntgen Impedanz zu bewerten.
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Disclosures
Dieser Artikel ist Teil einer Sonderausgabe über Multimodal Pre-Clinical Imaging, gesponsert von Bruker Biospin.
Materials
Name Company Catalog Number Comments Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO) Bruker; Billerica, MA Ketamine Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA 26637-411-01 Xylazine Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA 4821 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium) Lonza; Walkersville, MD 17-513F Sodium chloride Amresco; Solon, OH 241 Potassuim chloride Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ P217-3 Calcium chloride Sigma-Aldrich; St. Loius, MO C5080 HEPES Sigma-Aldrich; St. Loius, MO H3375 0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16" (8 mm) needle BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ 328438 References
Tags
Medizin Ausgabe 113 Neonatal Lunge,
