Abstract
웨스턴 블롯 등의 설립 방법과 더불어, 새로운 방법을 쉽고 빠르게 synucleopathies의 실험 모델에서 질병 관련 α-synuclein의 (αS D)를 정량화하기 위해 필요하다. 과발현 인간 A53T의 αS를 자발적으로 체중 감소, 쇠약, 및 심각한 운동 장애 등의 증상을 특징으로 나이 여덟 22 개월 사이 극적인 임상 표현형을 개발하는 트랜스 제닉 마우스 선 (M83)는이 연구에 사용 하였다. 이 마우스 αS D (질병 관련 αS)의 분자 분석을 위해, ELISA 특별히 아픈 쥐에서 αS D를 정량화하기 위해 설계되었습니다. 이 마우스 모델에서 중추 신경계의 분석은 주로 꼬리 뇌 영역과 척수 αS D의 존재를 보여 주었다. 즉, 임상 질환으로 이어지는 다른 실험 조건 사이의 αS D 분포의 차이는 uninocul에 없었다ated 정상적으로 형질 전환 마우스를 노화와 병 마우스의 뇌 추출물 접종 생쥐에서. Ser129에 대한 항체를 사용하여 αS D 면역 반응의 구체적인 검출은 본질적으로 웨스턴 블롯 및 면역 조직 화학에 의해 얻어진 그 상관 관계를 ELISA로 αS를 인산화. 예기치 않게, 유사한 결과 αS의 C 말단 부위에 대해 여러 가지 다른 항체를 관찰 하였다. "프리온 같은"기구의 관련을 암시 αS D의 전파는, 쉽게 감시되고 따라서, ELISA 접근법을 사용하여이 마우스 모델에서 정량화 할 수있다.
Protocol
모든 절차와 동물을 포함하는 프로토콜은 EC 지침 609분의 86 / EEC 및 오는, 동물 실험 (프로토콜 11-0043)에서 윤리의 고려에 대한 프랑스의 국가위원회의 비준을 따라했다. 동물 보관 및 ANSES의가 (0801 69387 승인 B) 리옹에 실험 시설을 승인에 마음에 든다고했다.
마우스 1. 준비
- 펜토 바르 비탈 나트륨의 치사량의 복강 내 주사하여 마우스를 안락사.
- 마우스 두개골에서 뇌 전체를 검색 및 추출까지 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다.
- 자궁 경부 척수의 압축을 풉니 다.
참고 : 추출 αS 중 하나를 표 1에 나와있는 실험을 사용할 수 없습니다 시상 단면 후 또는 해부 마우스의 뇌에서 뇌 반쪽의 하나에서.
| Experimen티 | 마우스 접종 (뇌에 해당) | 생존 기간 수 (dpi) | 중간 / 최대 생존 (일 이전) | 엘리사에 의해 D 감지 αS / WB / IHC |
| 1 | Uninoculated 마우스 | 441 ± 166 | 736분의 419 | 8/8 |
| (2) | 접종 한 마우스 (0.2 mg)을 | 150 ± 52 | 241분의 140 | 9/9 |
M83 마우스에서 수행 실험 표 1. 목록은. 예방 접종은 후, (포도당 1 % 중량 / 권 5 %) 아픈 마우스의 뇌 균질의 20 μL와 striato - 대뇌 피질의 영역에서 실험이 6 주에 실시 하였다 3 % 이소 플루 란 흡입 6 주 오래 된 동형 접합 M83 마우스의 마취. dpi로는 : 일 inocul 게시ATION.
뇌 반쪽 2. αS 추출
- Sagittally 두 개의 반쪽을 얻기 위해 뇌를 잘라. 그라인딩 볼을 넣은 ribolysis 튜브에 각각 절반을 단다.
- 에 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM의 염화나트륨, 5mM의 EDTA, 1mM의 DTT, 1 % 인산 및 프로테아제 저해제 칵테일을 함유 고염 (HS) 버퍼를 준비한다. 20 % (중량 / 부피) 균질를 얻기 위해 뇌의 절반에 높은 소금 버퍼를 추가합니다.
- 6.0 M에서 기계 균질화를 사용하여 뇌의 반쪽에서 샘플을 준비 / S 23 초 동안 두 번. 첫 번째 23 초 균질화 한 후, 두 번째 23 초주기 전에 2 분 동안 얼음에 균질을 포함하는 튜브를 배치합니다.
- 5 분 unground 뇌 조각을 제거하기 위해 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 200 μL 씩에 분할 이후 ELISA 분석을 위해 -80 ° C에서 그들을 유지, 상층 액을 복구 할 수 있습니다.
해부 두뇌 지역에서 3 αS 추출
- 해부끝 해마를 해부 할 때를 제외하고 함께 보관이 forcipes를 사용하여 낮은 전력 돋보기 (8 배 확대)와 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 전체 뇌. 뇌의 무결성을 유지하기 위해 10 분을 초과하지 마십시오. 뇌를 놓고 바로 옆이 순서대로 다음과 같은 뇌 영역을 검색 :
- 단지 전구 뒤에 배치 집게를 사용하여 두 개의 후각 전구 별도의 하나. 아래쪽으로 이동에 의해 뇌에서 분리. 두 번째 전구에 대해이 작업을 반복합니다.
- 조심스럽게 두 대뇌 피질 사이에 집게를 쐐기 두 대뇌 피질의 분리를 용이하게하기 위해 앞으로 이동합니다. 한 집게와 장소에 두뇌를 유지, 해마에서 대뇌 피질을 분리하는 또 다른를 사용합니다.
- 집게에게 피질 아래 2mm를 놓습니다. 해마의 상단이 보일 때까지 집게에 부드러운 압력을 유지한다. 피질의 첫 번째 부분을 벗겨, 두 번째 부분 반복합니다. 두 개의 대뇌 피질을 분리 집게를 사용하여해마에서 시작하여 뇌의 앞쪽으로 이동.
- 해마 중 하나 주위에 오픈 집게를 놓습니다. 부드럽게 최대한 복구, 제거 해마의 하단에있는 집게를 닫습니다. 두 번째 해마에 대해이 절차를 반복합니다.
- 선조체의 하나 아래 열린 집게를 놓고 부드럽게 뇌에서 분리. 선조체에서 남아있는 피질을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 두 번째 선조체에 대해이 절차를 반복합니다.
- 부드럽게 뇌에서 소뇌의 분리를 용이하게하기 위해 2mm 소뇌의 윤곽에 의해 우울하기 위해 집게를 사용합니다. 다만 소뇌 뒤에 집게를 놓고 앞으로 집게를 이동하여 제거합니다.
- 이 뇌간에 가입되는 시점을 명확하게보기 위해 중뇌 인상 집게의 넓은 부분을 사용합니다. 교차점에서 수직 절개 후 뇌간을 제거합니다.
- , 중뇌 뒤 집게를 배치하는 나는네 개의 둥근 구조로 구성 s의. 중뇌가 완전히 남아있는 뇌에서 분리 될 때까지 수직으로 절개.
- 가변 % HS 버퍼 (중량 / 부피), 가능한 조직의 양에 따라, 즉, 10 및 30 mg의 간 중량 5 % 파쇄, 30 및 80 mg의 간 중량 10 %, 및 20 %의 균질 준비 80 mg의 위의 무게.
- 균질 예상 %를 얻기 위해 해부 뇌 영역에 HS 버퍼의 적절한 볼륨.
- 소용돌이와 조직을 완전히 고속 버퍼에 포장되어 있는지 확인합니다.
- 붕규산 유리 튜브 및 두 방앗, 및 B. 이루어지는 조직 분쇄기로 해부 뇌 영역 또는 자궁 척수로부터 제조 된 샘플 균질화
- 튜브에 직접 분쇄 할 각 뇌 영역을 따르십시오. 튜브에 유봉을 삽입하고 철회. 조직을 떼어 놓다하기 위해이 운동을 약 10 회 반복한다. 그리고 C에 유봉 (B)를 사용상기 (20)의 움직임과 함께 조직 연마 ontinue. 1 ml의 전송 피펫 1.5 ML 튜브에 균질을 전송합니다.
- 어떤 unground 뇌 조각을 제거하기 위해 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. , 상층 액을 검색 200 μL 씩에 그들을 분할 이후 ELISA 분석을 위해 -80 ℃에서 보관하십시오.
ELISA에 의해 αS 4. 검출
- 0.01 ng를 / ㎖으로 코팅 된 항체를 희석. 50 mM의 나 2 CO 3 / NaHCO3를 완충액 (pH 9.6)에 반 αS 토끼 폴리 클로 날 또는 단일 클론 클론 (42) 항체를 사용합니다.
- 코트는 96 웰 마이크로이 코팅 용액을 잘 당 100 μL, 그리고 4 ° CO / N에 둡니다. 검출 항체를 사용하여 ELISA를 syn514 용 코팅 용액에 안티 αS 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용하여 42 LB509, AS11, 4D6 또는 8A5 클론. 코팅 용액으로 안티 αS 모노클로 날 항체 클론 (42)을 사용하여항 pSer129 αS 검출 항체와 조합.
주 : 플레이트 ELISA 일주일 전에 4 ℃에서 유지 될 수있다 필요한 경우 수행된다. - 물론 당 0.05 % 트윈 20 (PBST)와 플레이트를 인산 완충 생리 식염수 300 μL로 5 회 씻어 접시 세척기를 사용합니다. 이후이 단계에서 배양 실온에 있습니다.
- T20 PBS를 잘 당 버퍼를 차단의 200 μl를 추가합니다. 150 rpm에서 1 시간 동안 흔들어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
- (: 20 % 균질 100을, 10 %의 균질 1:50 PBST BSA 1 %에서 5 %의 균질 1시 25분 희석 1)를 각 웰에 100 μl를 추가 뇌 균질 액을 희석한다. 150 rpm으로 진탕하면서 다음 2 시간 동안 품어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
- 자료 목록에 언급 된 희석에서 BSA와 PBST 1 %를 다른 αS 검출 항체를 추가합니다. 150 rpm에서 1 시간 동안 품어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
- 안티를 추가150 rpm에서 진탕하면서 1 시간 동안 1 % BSA로 보충 PBST로 8000 : - 마우스 또는 항 - 토끼의 IgG HRP 접합체 (1) 희석 하였다. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오.
- 각 웰에, 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 솔루션 '3,3의 100 μl를 추가하고 150 rpm으로 흔들어 동안 어둠 속에서 15 분 동안 품어.
- 그럼 마이크로 플레이트 리더와 450 nm에서 흡광도 측정에 1 N의 HCl 100 μl를 첨가하여 반응을 정지.
- 데이터 분석을 위해, 분석 시료의 각각에 대해 측정 된 OD 값으로부터 임의의 마우스 뇌 샘플 (블랭크 웰)을 제외하고 모든 시약 웰에서 얻어진 OD 값을 뺀다.
5. 에피토프 매핑
- 오스만 (16)에 의해 기술 된 방법에있어서, 에피토프 맵핑을 수행한다. 간략하게, 10 중첩 아미노산 니트로 셀룰로오스 12 개의 아미노산을 함유하는 인간 α-synuclein의 시퀀스의 스폿 펩타이드.
- 50mM 트리스 / 150 mM의 염화나트륨 완충액 pH 1 차단0, 0.05 % 트윈 20, 5 % 우유 분말을 함유. 2-10 ° CO / ml의 N에서 당 2 μg의 항체 농도에서 차단 용액에 항체 인큐베이션.
- 세포막을 50mM 트리스 / 150 염소 항 - 마우스 IgG HRP 컨쥬 게이트 0.05 % 트윈 20을 함유하는 인큐베이션 mM의 염화나트륨 완충액 pH 10을 사용하여 세 번 씻는다. 다음 같은 버퍼를 사용하여 다른 5 배 웨스턴 블롯 TMB 염색 키트를 사용하여 얼룩 막 씻으십시오.
6. 통계 분석
- 외경을 모델로 혼합 효과 회귀 분석을 수행하기 위해 R 소프트웨어와 NLME 패키지를 사용합니다. 각각의 비교를 위해, 혼합 효과 회귀 모형을 수행합니다. 무증상 그룹에서 증상을 구분하는 고정 효과를 사용합니다.
- 주어진 마우스 반복의 변화를 반영하기 위해 임의의 효과를 사용합니다. 잔류 물을 검사하여 homoscedasticity 확인하고, 필요한 경우 및 핀 헤이 베이츠 1에 아울러 집단 내 에러의 분산 구조를 모델링 분산 함수를 사용7. (P)의 중요성 임계 값 0.05을 설정
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Representative Results
이 연구에서 사용 된 ELISA를 특별히 아픈 M83 마우스에서 높은 소금 버퍼에 준비 뇌 균질 질병 관련 αS (αS D)를 확인했다. 특히 pSer129 αS (P = 0.0074)를 인식하는 항체를 사용하여 ELISA 쉽게 젊은 (구 2-5개월), 건강 M83 마우스 (그림 1)에서 이전, 아픈 마우스 (> 8 개월)를 구별한다. 몇 가지 다른 항체는 유사하게 높은 신호 만 아픈 마우스의 뇌 균질 (> 0.6 OD)를 보여 주었다. 이 4D6에 대한 경우 (P = 0.01) 단백질 (124-134, 115-122의 C- 말단 부분의 다른 시퀀스에 대하여, LB509 (P = 0.0047) 및 8A5 (P <0.001), 그리고 129-140입니다 각각)과, 훨씬 적은 정도로 단백질 (p = 0.0003)의 N 말단 (2-12)에 대하여 syn514. 또한, AS11 모노클로 날 항체는 C57BL / 6S의 예방 접종 후 인간의 섬유의 재조합 αS 18 (B6의 αS-NULL) (19)에 대한 우리의 실험실에서 생산α-SYN 궤적의 삭제와 마우스 만 아픈 마우스의 뇌 균질 유사하게 높은 신호 (P <0.01)를 보였다. 이 항체는 지금 인간 α-시누 클레인의 서열 118-125에 대응 αS의 아미노산 서열 (P) VDPDNEAY (E)를 인식하는 것으로 나타났다.
반면, 이러한 실험 조건에서, α-synuclein의 (91-96 순서)의 중앙 영역에 대하여 지시 복제 (42) 검출 항체와 뇌 균질의 분석은 모두 아프고 건강 M83 마우스에 대한 매우 낮은 신호를 보여 주었다. 이 마우스의 두 집단 (P = 0.1158)를 구별 할 수 없습니다. 젊은 M83 마우스는 그럼에도 불구하고 비 형질 전환 B6C3H 마우스를보다 더 높은 면역 (M83 유전 적 배경 라인)을 보여 주었다. 대조는 C57BL / 6S로 삭제 된 α-SYN의 궤적이 (B6의 αS 널) 마우스, 더 큰했다. 이 M83 마우스에 약간의 면역이 정상 αS의 낮은 신호 검출에 대응하는 것이 좋습니다.이 ELISA의 nalytical 감도와 비교하여 평가 하였다 이전 ELISA 및 웨스턴 블롯 방법, 동일한 환자 M83로부터 제조 뇌 균질의 연속 희석을 모두 사용하여, 검사하여, 불용 Ser129 인산화 된 α-시누 클레인의 검출을 위해 웨스턴 블롯 방법 4 바와 마우스의 뇌 (그림 2). 대략 10 μg의 뇌 등가물 LB509과 PSer129 항체 모두,이 아픈 마우스의 뇌 균질에 대한 긍정적 인 ELISA 신호를 얻기에 충분했다. 반대로, 적어도 200 μg의 뇌 당량 동일한 PSer129 항체 15를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석 sarkosyl 불용 분획에서 pSer129 αS를 검출하기 위해 필요했다. 이 ELISA는 분석 감도를 웨스턴 블롯 방법의 일부 20 시간이 있음을 나타냅니다.
아픈 옛 M83 마우스 (그림 3A), 중뇌에서 뇌 균질, 뇌간 및 척수 소에서 물은 ELISA에 LB509과 PSer129 항체 모두 면역을 표시했다. 그러나, 검출 가능한 면역 반응 후각 망울, 대뇌 피질, 선조체, 해마, 시상 및 시상 하부를 포함하여, 다른 뇌 영역에서 관찰되지 않았다. ELISA는 소뇌에 대한 희미한 신호를 주었다. 아픈 M83 마우스 4 (그림 3B)에서 뇌 추출물의 주입 다음 가속 임상 질환을 개발 M83 마우스의 서로 다른 뇌 영역의 면역 반응성은 M83 마우스를 uninoculated 세 (오래된> 8 개월)에서 본 것과 구별했다. 이러한 결과는 뇌와 척수의 꼬리 지역에서 Ser129의 α-synuclein의 훨씬 더 침착을 보여주는 웨스턴 블롯 (그림 3C) 및 면역 조직 화학 (15)에 의해 얻은 결과와 완전히 일치한다.
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M83 마우스에서 전체 뇌 균질 질병 관련 α-synuclein의 (αS D) 1. ELISA 검출 그림. syn514와 ELISA 결합 토끼 항 αS 클론 (코팅) LB509은 AS11은, 4D6, 8A5 항 pSer129 αS (PSer129)와 (감지) 또는 복제 (42) (코팅) (검출) 항체는 건강한 M83 마우스 아픈 생쥐 구별 안티 αS 토끼 클론와 ELISA (코팅) / clone42 (검출) 반면 그렇지 않습니다. 11-16개월 세 여섯 병, 오래된 M83 마우스는 (클론 (42) 항체 제외) 항 α-SYN 항체와 면역 반응의 징후를 보여 주었다. 이 2 ~ 5 개월에서 세 중 여섯 젊은, 건강한 쥐의 경우되지 않았거나 B6C3H 또는 B6 αS 널 마우스 (M83 마우스의 유전 적 배경)를 포함하여 추가 컨트롤. 오차 막대는 Bétemps 15에서 수정 된 SD를 나타냅니다.
긍정적 인 신호가 아픈에서 뇌 균질의 2 배 희석액에서 12.5 μg의 두 LB509와 뇌의 등가물 및 PSer129 항체에 대한 ELISA 얻었다 ELISA 및 웨스턴 블롯. (A)에 의해 αS D의 검출 분석 감도 그림 2. 비교 쥐. ELISA 측정 + 3 표준 편차의 3-6 반복하는 동안 건강한 M83 마우스의 샘플에서 얻은 수단에 해당하는 환자와 건강한 쥐의 차별에 대한 추정 차단 레벨은 각각 LB509과 PSer129 검출 항체 0.030과 0.020이었다 . 이들은 항체의 각각에 대해 사용 된 것과 동일한 컬러로 라인을 나타낸다. B.를 presen와 초 원심 분리에 후에 얻어진 불용성 분획을 웨스턴 블롯 분석에 의해sarkosyl의 CE가 200 μg의 뇌 등가물은 동일한 항체 PSer129 αS D를 검출하기 위해 필요했다. (kDa의에서) 분자량 마커는 얼룩의 왼쪽에 표시됩니다. Bétemps (15)의 허가 재판.
ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 M83 마우스의 다른 뇌 영역에서 질병 관련 α-synuclein의 (αS D)의 그림 3. 탐지. ELISA는 PSer129 또는 LB509 검출 정상 노화 () 동안 M83 마우스의 항체 (N = 1, 4 반복, 평균 ± SD) 또는 아픈 M83에서 뇌 균질 6 주 된 M83 마우스의 접종 후와 αS D를 확인 ( B) (N = 1, 4 반복은) ± 표준 편차 의미한다. (C) αS D는 W에 의해 식별 된estern 아픈 M83 마우스의 뇌 균질 접종 생쥐 같은 신경 해부학 적 영역에서의 PSer129 검출 항체 EP1536Y과시킨다. (kDa의에서) 분자량 마커는 총 단백질의 동등한 양의 젤에 해당하는 하중에 대한 각 라인에 사용 된 패널 C의 왼쪽에 표시됩니다. 아픈 M83 마우스의 다음 팔 신경 해부학 적 영역을 시험 하였다 : OB를 : olfactive 전구, CX : 대뇌 피질, 안녕 : 해마, ST : 선조체 (striatum), 나 : 중뇌,의 Cb : 소뇌, 학사 : 뇌간, SC : 자궁 경부 척수 . Bétemps 15에서 수정.
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Discussion
ELISA의 사용은 구체적 M83 트랜스 제닉 마우스 모델에서 질병 중에 마우스 뇌 균질 물로부터 직접 αS D를 검출하는 것으로 입증되었다. 사실,이 ELISA 쉽게 높은 소금 버퍼 만 전체 뇌 균질를 사용하여 건강한 M83 마우스에서 아픈 M83 마우스를 구별 할 수있다.
이 ELISA를 사용하여 성공적인 결과를 위해 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 제대로 해부하는 동안 손상을 방지하기 위해 필요한 손재주를 개발하여 마우스 뇌의 다른 영역을 해부; 독점적 HS 버퍼에 샘플 희석을 수행하는 단계; 항체의 선택은, 모든 항체는 ELISA 형식으로 작동하기 때문이다.
αS D 수준의 일부 변화는 다른 생쥐 사이 그럼에도 불구하고 분명했다. 이러한 결과는 시험의 사크 의해서만 아픈 M83 마우스에서 검출 전형적인 αS D 패턴의 웨스턴 블롯 검출 동등Ser129에 대한 항체와 탐지 후 osyl 불용성 분획 αS 15 인산화. 이 ELISA 면역이 αS D의 특정 검출에 해당 보여줍니다.
이전 웨스턴 블롯와 계약 (15)를 분석,이 ELISA뿐만 아니라 자궁 경부 척수로, 뇌, 즉, 중뇌 및 뇌간의 꼬리 부분에 아픈 M83 마우스의 뇌의 해부 후 면역을 발견했습니다. 어떠한 면역 반응은 후각 망울, 대뇌 피질, 선조체 또는 해마가 섬유의 알파에서 접종되었다 쥐의 경우에 매우 낮은 수준 않는 병리학 적 과정 (6)에 의해 절약 된 것을 나타내는 이전의 데이터와 일치 해마에서 검출되지 않았다 해마 (15)에 -synuclein. αS D의 분포는 따라서 inc를하는 현저하게 균일 한 전체, 어떤 실험 조건 등장luded 중 쥐의 정상 노화 또는 아픈 M83 마우스의 뇌 균질의 내 뇌 접종 후 질병의 개발을 가속.
또한, 분석 성능은 전술 웨스턴 블랏 방법보다 더 낫다. 병든 M83 마우스 (웨스턴 블롯 분석 용 200 μg의 VS ELISA 12.5 μg의)로부터 뇌 파쇄 액의 연속 희석을 사용하여이 시험에서 얻어진 검출 한계와 같이 ELISA의 분석적 감도는 높은 나타났다. ELISA의 민감도 그러나 이러한 대뇌 피질 (15)로 각 셀과 정면 뇌 영역에서 αS D를 검출 면역 검출보다 낮게 유지되었다. 시험의 민감도는 이전에 상기 그럼에도 13 바와 같은 화학 발광 검출 상이한 항체 및 / 또는 최적화 된 검출 시스템을 사용함으로써 개선 될 수있다.
그것은 중요하다여러 가지 다른 항체가 단백질의 다른 형태를 인식하고, 특히 (4D6 단일 클론 항체 (20)로 검출) 인산화되지 않은 형태가 특별히 pSer129 αS를 인식하는 모노클로 날 항체 이외에, 이러한 ELISA를 사용하여 유사한 결과를 준 점에 유의한다. 이 ELISA 방법은 아픈 마우스 (15)의 같은 아픈 동물 및 / 또는 뇌 영역에서 훨씬 낮은 정도까지 구체적으로 인간의 αS (LB509)과, 인식하는 항체, 마우스 αS (D37A6)와 면역를 한 것으로 밝혀졌습니다. 한편, 어떠한 면역 반응이 ELISA 조건 애매한 수 에피토프에 대응 αS (91-96) (21, 22)의 중앙 영역에 대해 클론 42 항체를 사용하여 환자 M83 마우스의 ELISA 분석에 의해 관찰되지 않았다. 올리고머 형태를 인간 혈장에 폴즈 (11)에 의해 관찰하고, 아마도, 비 - 인산화 같이 잡음에 기재 한 바와 같이 ELISA 포맷은, M83 마우스 뇌 모두 인산화 된 Ser129에 검출 할 수 αS혈장 및 뇌척수액 (12, 14). 이전에 출판 된 ELISA를 달리 우리 ELISA 포맷 αS의 올리고머 형태를 검출하는 검출 캡처 및 동일한 항체를 둘 다 사용되지 않으며, 공지 된 항체 Unterberger의 연구에 사용 된 항체 5G4 같은 구조적한다.
이전 M83 마우스 (4)로부터 뇌 균질 αS D를 검출하기 위해 사용 웨스턴 블랏 방법과 달리, ELISA는 질병 - 관련 단백질 (23)을 검출하기 위해 그러한 sarkosyl와 초 원심 분리 등에 의해 농축 단계가 필요하지 않았다. 질병과 연관된 αS 이전 강도 2,6 증가 버퍼를 사용하여 연속 추출 M83 마우스에서 확인 하였다. 실용적인 관점에서,이 정량적 분석은 웨스턴 블롯 절차에 비해 상당한 시간과 시약을 절약 할 수 있습니다.
본 연구에서는, ELISA 접근법을 사용 상세한 αS 분자 분석하는 것이 가능했다쉽게 아픈 M83 마우스에 다른 항체와 면역 반응을 정량화. 그것은 양적 관점에서 synucleinopathies 동안 αS 집계에 관련된 분자 메커니즘을 밝혀 수 있습니다. 이 ELISA 방법 따라서 폴즈 (11)가 쇼에게 비 인산화보다 진단 마커로 더 약속을 믿고 같은 Ser129 인산화 αS과 병리학의 신뢰할 수있는 마커로 다양한 생물학적 샘플에서 αS D를 검출하는 빠르고 쉬운 도구의 기초를 제공 할 수 단백질. 최근에는 총 αS의 레벨이 초기 증상 (24)의 출현 후 시간이 지남에 따라 증가하는 경향이 가능한 비 인산화 αS 총 αS 또는 대책이 PD에서 질병의 진행에 대한 대리 마커로서 사용될 수 있다는 사실을 지적 .
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Acknowledgments
저자는 예방 접종에 대한 데미안 가일 라드 감사 및 후속 동물 실험을하고 싶습니다. 이 작품은 ANSES (식품, 환경 및 산업 보건 및 안전을위한 프랑스 기관)에 의해 재단 프랑스 파킨슨에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB509 | Abcam | ab27766 | Detection antibody 1/2,000 |
| AS11 | Produced at Anses | Detection antibody 1/1,000 | |
| 4D6 | Abcam | ab1903 | Detection antibody 1/2,000 |
| PSer129 | Abcam | ab59264 | Detection antibody 1/3,000 |
| PSer129 EP1536Y | Abcam | ab51253 | Detection antibody 1/1,000 |
| syn514 | Abcam | ab24717 | Detection antibody 1/500 |
| clone 42 | BD Biosciences | 610787 | Coating and detection antibody (1/2,000) |
| 8A5 | Provided by Dr. Anderson | Detection antibody 1/2,000 | |
| polyclonal anti-αsyn antibody | Millipore | AB5038P | Coating antibody |
| Anti-mouse IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 1010-05 | |
| Anti-rabbit IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 4010-05 | |
| Goat anti-mouse IgG HRP conjugate | Dianova | 115-035-164 | |
| HS buffer | Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C | ||
|
Euromedex | 26-128-3094-B | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | EU0007-B | |
|
Sigma | 43815 | |
| PBS | Adjust at pH 7.5 | ||
|
Euromedex | 1309 | |
|
Euromedex | 2018 | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | P017 | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-C | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| DTT 1 mM | Sigma | 43815 | Stock solution 100 mM, toxic |
| 1% phosphatase cocktail | Pierce | 78428 | |
| 1% protease inhibitor cocktail | Roche | 04 693 132 001 | 50x concentrated |
| Microplate MaxiSorpTM | Thermo Scientific | 442404 | |
| Tampon carbonate 50 mM pH 9.6 | |||
|
Sigma | 71360 | 2.86 g/L |
|
Merk | 6329 | 3.36 g/L, pH 9.6 |
| Superblock T20 PBS blocking buffer | Pierce | E6423H | 10x concentrated |
| TMB | Sigma | T0440 | Used for ELISA |
| TMB | Analytik Jena AG | 847-0104200302 | Used for epitope mapping |
| HCl 1 N | Chimie plus | 40030 | |
| Ribolyser | Thermo | Fast prep FP120 | keep on ice at this step |
| Grinding tubes | Biorad | 355-1197 | |
| Plate washer | Tecan | Columbus Pro | |
| Plate reader | Biorad | Model 680 | |
| Low power magnifier | VWR | 630-1062 | 8X magnification |
| Forceps Dumont#7 | WPI | 14097 | For dissection steps |
| Transfer pipette 1ml Samso | Samso | 043231 | |
| 1.5 ml tubes | Dutscher | 033290 | |
References
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