Abstract
הערכה היסטולוגית של ביופסיות שריר שימשה ככלי הכרחי בהבנה של ההתפתחות וההתקדמות של הפתולוגיה של הפרעות עצבית-שרירית. עם זאת, על מנת לעשות זאת, טיפול נכון צריך לקחת כאשר מוציא ושימור רקמות להשיג צביעה אופטימלית. אחת שיטות לשימור רקמות כרוכה תיקון רקמות בפורמלין ולאחר מכן הטבעתם בשעוות פרפין. שיטה זו שומרת מורפולוגיה היטב ומאפשרת לאחסון לטווח ארוך ב RT, אבל הוא מסורבל ודורשת טיפול בכימיקלים רעילים. יתר על כן, תוצאות קיבעון פורמלדהיד בקישור צולב אנטיגן, אשר מחייב פרוטוקולים אחזור אנטיגן לimmunostaining היעיל. להיפך, חתך קפוא אינו דורש קיבוע ובכך שומר על קונפורמציה אנטיגן ביולוגית. שיטה זו גם מספקת יתרון בולט בסיבוב מהיר סביב זמן, מה שהופך אותו לשימושי במיוחד במצבי צורך הערכה היסטולוגית מהירה כמו intraoperative ביופסיות כירורגיות. כאן אנו מתארים את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר להדמיה עם כתמים היסטולוגית וחיסוניים שונים.
Introduction
בדיקה של היסטולוגיה השריר משחקת תפקיד קריטי בהבנת סוגים שונים של הפרעות עצבית-שרירית של 1-4. בשילוב עם טכניקות אחרות, זה מאפשר לחוקרים לקבל מושג טוב יותר של הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה וגם יכולים להיות חיוני כדי להעריך את היעילות של התערבות טיפולית 5-10. עם זאת, כדי להיות מדויק, הרקמות צריכה להישמר בצורה הנכונה על מנת לשמר את המצב הפיזיולוגי מייד לפני הכריתה. זה דורש זהירות רבה במהלך ההסרה, שימור, חתך, וצביעה.
ניתן להכין רקמות בשתי דרכים שונות למחקר מיקרוסקופי אור. השיטה, פרפין פורמלין הקבוע הראשון משובץ קטעים (FFPE), דורש רקמות להיות קבועים בפורמלין שנאגרו טבעי 10% לפני שמוטבעים בשעוות פרפין 11,12. צעד הקיבעון עוזר לשמר מורפולוגיה טובה יותר, אבל יחסי ציבור אנדוגני קישורים גם צולביםoteins לפיכך מחייב נהלים אחזור אנטיגן המורכב עבור immunostaining ומבטל את האפשרות של מכתים האנזימטית בסעיפים כגון 12. חלקים קפואים, לעומת זאת, לא צריכים להיות מראש קבועים או מעובד; לכן, חלבונים יכולים לשמור תצורות ביולוגיות יליד 13,14. יתר על כן, חלקים קפואים גם לאפשר לזמן אספקה מהיר, שלעתים יש צורך, למשל באבחון תוך הניתוחי של סרקומות וביופסיות כירורגיות אחרות 15. עם זאת, אם לא נעשה כראוי, בשיטה זו היא נוטה להקפיא נזק, אשר מציג שינויים בארכיטקטורת שרירים מה שהופכים את החלקים שאינם ראויים לבדיקה היסטולוגית. מאמר זה מתאר את השיטה היעילה ביותר להכנת ביופסיות שריר על מנת להשיג צביעה אופטימלית לבדיקה נאותה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. רקמות קציר והקפאת רקמות שריר
- להרדים את העכבר עם מנת יתר של isoflurane (2-כלורו-2- (difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-אתאן). לבצע שלב זה במנדף ולהשתמש בשיטת בלימה משנית כגון ייבוש או צנצנת פעמון המכילה מקלון צמר גפן הטבול בisoflurane.
- לאשר מוות על ידי תקיפות לוחצים שודד דרכים. להשתמש בשיטה משנית של המתת חסד כגון נקע בצוואר הרחם.
- להרטיב את הפרווה עם אלכוהול 70% כדי לצמצם את דבק של קווצות שיער רופפות על השרירים. לקלף את העור מהאיבר באמצעות מלקחיים עדינים כגון מס '5.
- בזהירות להפריד את השריר של עניין (tibialis קדמי (ת"א) במקרה זה) מהעצמות מתחת, החל מהגיד ולהסיר.
- בלו השריר, לכסות אותו באוקטובר (מתחם טמפרטורה אופטימלי חיתוך), ולהניח אותה שטוח על תבנית הקפאה חד פעמית שכותרת. ודא שהשרירים הוא בה נטייה פיזיולוגית נורמלית (ועד ראש טאייב) ללא מתיחה. לחלופין, להקפיא את השריר על ריבועי קלקר קטנים ולהצמיד אותו באמצעות סיכות חרקים כדי להבטיח את האורך הנכון של השרירים.
- צ'יל 2-methylbutane (איזופנטאן) בכוס פלדה באמצעות חנקן נוזלי. זה לוקח על 3 ממוצעת - 5 דקות. שמור ערבוב לסירוגין עד משקעים לבנים מתחילים טופס בתחתית והקירות של הכוס.
הערה: כאשר זה קורה, הגיע איזופנטאן טמפרטורת הקפאה אופטימלית (-150 ° C) - טובלים את התבניות המכילות שרירים ב2-methylbutane המצונן. להקפיא את השרירים קטנים כגון longus digitorum הסרעפת והפושטים (אדי) במשך 6 - 12 שניות ושרירים גדולים יותר כמו soleus הגסטרוקנמיוס (GS) והיד אחורית במשך 15 - 20 שניות. אין להקפיא את השרירים במשך זמן רב מדי שכן הדבר עלול להוביל לפיצוח.
- העבר את הרקמות הקפואות בקרח יבש וללתת להתאדות איזופנטאן (שים לב שתהליך זה לוקח בממוצע כ -15 - 20 דקות). לעטוף את הרקמות ברדיד אלומיניום ולאחסן אותם בuטמפרטורת ltra נמוכה (C -70 ° C עד -80 °) עד חתך.
2. Embedding הרקמות ב אוקטובר להכין בלוק רקמות
- רקמות תחבורה על קרח יבש לcyrostat כדי למנוע הפשרה. העברת רקמות לcryostat קאמרית (שנקבע ב -20 ל-24 מעלות צלזיוס, כדי למנוע הפשרה מלאה של רקמות) ולתת להם לאזן במשך 30 דקות.
- הפעל מפרץ פלטייה קירור ב. אם cryostat אין קירור זה, להשתמש בתרסיס קירור תרסיס להקפיא במהירות OCT. אל תתנו להפשרת שרירים בכל נקודה במהלך ההטבעה כמו זה יכול לגרום לנזק הקפאה.
- להוסיף שכבה דקה אחידה של אוקטובר בדיסק הדגימה ולתת לו מגניב. כאשר רוב OCT קפוא בתחתית ועדיין נוזליים על גבי, הכנס את הרקמה בכיוון הנכון (בניצב לאוקטובר לסעיפים ומקביל רוחביים לאוקטובר לסעיפים אורך). להשתמש בתרסיס קירור תרסיס להקפיא במהירות אוקטובר לגעת בחלק unembeded של הרקמות עם שלוחה חוםractor ולחכות 45 שניות.
- להוסיף עוד שכבה דקה של אוקטובר סביב השריר, לרסס עם תרסיס קירור תרסיסים ולחלץ את החום כמו בשלב הקודם.
- לשמור על הוספת אוקטובר במרווחים קטנים ובמהירות להקפיא ב- OCT באמצעות שילוב של תרסיס ספריי קירור וחולץ חום עד שכל השריר מכוסה.
- שים חולץ החום בחלק העליון של בלוק הרקמה ולחכות 5 דקות.
3. הכנת סעיפים וזיהוי הסעיפים מאזור אמצע בטן של השרירים
- הר הדגימה על ראש הדגימה. הדק את הידית כדי לאבטח את הדיסק. ודא שהדיסק הדגימה הוא במגע טוב עם ראש הדגימה.
- כוון את טמפרטורת החדר לבין -21 ו-24 מעלות צלזיוס ולחכות עד שטמפרטורת הסט מושגת.
- התאם את הגדרות העובי (7 מיקרומטר); חתוך את הבלוק על ידי קידום או חוזרים בי לחסום באמצעות הגדרות גסות ועדינות.
- לאסוף את החלקיםבטרום חימם שקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובי על ידי לחיצה על גבי השקופית על הסעיפים, באמצעות המשיכה בין מטענים המנוגדים כדי להקל על הדבקות של החלקים לחתוך לשקופית.
- זהה את החלקים באמצע הבטן-ידי מדידת שטח חתך (CSA) של החלקים. האם תוכנת הדמיה באמצעות זה במחשב שמחובר למיקרוסקופ.
הערה: תמונות בניגוד השלב נלקחות והיקף של כל השריר נמדד באמצעות פונקצית מעקב על התוכנה. זו תניב שני CSA כמו גם קוטר חמוס מינימום (מדד לגודל חתך סיבים שמתבטא במרחק הקטן ביותר בין שני משיקים מקבילים בצדדים מנוגדים של חלקיק) מדידות. הערה: כאשר מדידות CSA וקוטר חמוס מינימום מתחילות רמה, כבר הגיעה באמצע הבטן. - מלאי וארכיון השקופיות ב -80 ° C לצביעת עתיד.
הערה: Oct לא צריך להסיר לפני staininנהלי g. ברגע שקופיות coverslipped, הם מוכנים להיות מוכתמים באופן מיידי.
4. מכתים
הערה: בעוד שניתן למצוא נהלי צעד-אחר-צעד מפורטים בגיליון הנתונים של המוצר וצריך להיות בעקבות הליכים מכתים, ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה אישי להשיג צביעה אופטימלית.
- בגלל ההרכבה תקשורת (ראה טבלה) היא לא בליל עם מים, מייבשים שקופיות באמצעות ציונים גוברים של אלכוהול (2 דקות כל אחד ב -70%, 95%, ו 100% אתנול) ולנקות אותם עם קסילן (5 דקות) 100% על מנת להבטיח מגלשות לא להיות אטומות לאורך זמן.
- Coverslip סעיפים ולתת להם להתייבש. תמונה עם מיקרוסקופ מצויד בתוכנת הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההגדרה לקציר והקפאת רקמות שניתן לראות באיור 1. רקמות נכרת צריכה להיות מאוחסנות בגזה טבולה בPBS להימנע (איור 1 א) ייבוש. כאשר רקמות נבחרו לשמש לניתוח היסטולוגית הם צריכים להיות טבולים בOCT ומונחים על תבנית cryo בכיוון הנכון וקרוב לאורך פיסיולוגי ככל האפשר כדי להבטיח מורפולוגיה מדויקת (איור 1). תרחיף של איזופנטאן המתאים להקפאה רקמה יכול להיות מושגת על ידי קירור איזופנטאן בחנקן נוזלי וערבוב עד משקעים לבנים קטנים יופיעו בתחתית. בשלב זה, התקשורת מתאימה להקפאה (איור 1 ג). יש להקפיא רקמות 6-15 שניות באיזופנטאן המצונן בהתאם לגודל / העובי של הרקמה (1D איור). בעקבות הקפאה, השרירים יופיעו לבנים של גיר ובשלב זה צריך להיות מאוחסן בקרח יבש ולאחר מכן הועברו ל-80 <> מקפיא מעלות צלזיוס חזק.
הגדרת cryostat ומרכיבים הנדרשים להכנת בלוק השריר על ידי הטבעת הרקמה ב אוקטובר בהדרגה מוצגות באיור 2. יש להגדיר cryostat בין -20 ו-24 מעלות צלזיוס (איור 2 א). OCT והקפאה-זה צריך להיות זמין כדי ליצור בלוק מתאים לחתך. בתוך cryostat צריכים מברשות קטנות כדי לתפעל ולשטח סעיפי קיצוץ לשקופית עושה כמו גם פינצטה לטיפול בגוש הרקמה כי זה לא צריך להיות נגע עם ידיים על מנת להבטיח את הרקמה נשאר קפואים (איור 2). יש להוסיף באוקטובר וה רקמות כדי ליצור בלוק חתך אבל יש להקפיא מייד עם הקפאה-זה לרסס ואז התקרר עוד יותר עם חום חולץ בתמונה כאן (איור 2 ג). לסעיפים רוחביים, רקמה צריכה להיות ממוקמת בראש הדגימה כך שהוא בכיוון מאונך ללהב (איור 2 ד). Seצריך להיות מותאם ttings להשיג עובי חלק הרצוי (5-10 מיקרומטר בהתאם לרקמות).
אם קפוא בצורה נכונה את פני הרקמה צריכה להיות גיר לבן ואילו רקמות שהוקפאה בצורה לא נכונה או מופשר בתהליך ההרכבה תופיע אדום / ורוד. איור 3 מראה רקמות נציג לדגימות טיפלו בצורה לא נכונה (איור 3 א) ודגימות מטופלות כראוי (איור 3) .
אזור בטן אמצע נקבע על ידי מדידת CSA וקוטר חמוס מינימום באמצעות מיקרוסקופ מצויד באופטיקה בניגוד שלב ותוכנת ניתוח תמונה. מסך נציג של תוכנת ניתוח מוצג באיור 4. Hematoxylin ו eosin תמונות צבעוניות של ביופסיה קפוא כראוי ומחולקת יחד עם ביופסיה פגומה הקפאה של tibialis קדמי שרירים (ת"א) מוצגים באיור 5. סעיפים שמעובדים כראוי יצטרך morpholo העקביGY ואפילו מכתימים לאורך (איור 5 א). שלא כדין מעובד שרירים שניזוקו או הקפאה בטרם עת מופשר תופיע לי הפסקות מרובות במורפולוגיה ויש את המראה של "חיטה גרוסה" (איור 5). איור 6 מציג תא humidified לimmunostaining האופטימלי. שקופיות צריכה להיות מכוסות בparafilm, המשיכו על מגבת נייר רטובה, ואטומות בקופסא קטנה, כדי למנוע התייבשות של חלקים במהלך immunostaining. איור 7 מציג מדגם שקופיות אימונוהיסטוכימיה שהוכנה כראוי ומוכתמת.
רקמות איור 1. הכנה ולהגדיר להקפאה רקמה תקינה. (א) נכרת צריכה להיות מאוחסנות בגזה טבולה בPBS. (ב) רקמות selectedfor היסטולוגיתניתוח טבול בOCT ומונח על תבנית cryo בכיוון הנכון (מהבטן לגיד) וקרוב לאורך פיסיולוגי ככל האפשר. Slurry (C) של איזופנטאן המתאים לרקמות. הערה: משקעים לבנים קטנים יופיעו בתחתית. רקמה קפואה לאחר הטבילה באיזופנטאן (ד '). הערה:. הופעת גיר לבנה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. הגדרות cryostat ומרכיבים דרושים לחתך. () Cryostat להגדיר בין -20 ו-24 מעלות צלזיוס עם ספריי קירור OCT ותרסיס זמינים. (ב) בתוך ההגדרה של cryostat להשלים עם מברשות קטנות כדי לתפעל ולשטח secti לחתוךתוספות לשקופית עושה, כמו גם לטיפול בפינצטה של גוש רקמה. (ג) בלוק רקמה קפוא מוכן להיות מקורר עם חולץ חום (חץ לבן). בלוק רקמות (ד) נקבע בהרכבת הראש מוכן לחתוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. רקמות נציג של שרירים השתמרו בצורה נכונה ולא נכון. () כיאות קפוא או טיפל (ב) כראוי קפוא וטיפלו שריר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
קביעת איור 4. של אזור חתך רוחב של שריר ת"א באמצעות תוכנת הדמיה ניקון. צילום המסך של תמונה לעומת שלב סעיף שרירים שכבר הקיפה באמצעות לדמיין תוכנה למדידת CSA וקוטר חמוס דקות. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.
איור 5. נציגי תמונות של שרירי H & E מוכתמות הוכנו כראוי ושלא כדין. () כראוי מעובד סעיף. סעיף שריר הקפאה פגומה מעובד כיאות (B). אנא CLICK כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. תא humidified המתאים לimmunostaining. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
שקופית אימונוהיסטוכימיה 7. דוגמא איור של שקופיות. שקופיות מוכנות כראוי ומוכתמות כבר מוכתמת בפיברונקטין (ירוק) ו DAPI (כחול). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה שימשו ככלים מרכזיים בהבנת הביטוי וההתקדמות של פתולוגיה בהפרעות עצבית-שרירית שונות. קלסי, ביופסיות שריר היו קבועות ראשונה בפורמלין ולאחר מכן משובצות בשעוות פרפין. בעוד קיבעון פורמלדהיד שומר ארכיטקטורת רקמה ומאפשר אחסון והובלת רקמה ב RT, זה גם מנטרל אנזימים וחלבונים crosslinks המחייב צעדים נוספים להשגת immunostaining מדויק. בעיה זו בוטלה עם השימוש בחלקים קפואים אך שיטה זו מציבה אתגרים טכניים ייחודיים בהשגת תוצאות אופטימליות מכתימה ו14,15 פרשנות מדויק.
ראשית, זה חיוני כי דגימות יוקפאו מייד לאחר כריתה כירורגית כautolysis ופירוק מתחילים מייד לאחר ההסרה מהגוף. רקמות גם חייבת להיות קפוא במהירות וביסודיות לכמות הנכונה של זמן המשתנה בהתאם לגודל/ עובי של הרקמה. אם זה לא נעשה בצורה נכונה, להקפיא נזק יתרחש עיבוד הרקמות חסרות תועלת להערכה היסטולוגית. בעקבות הקפאה, רקמות חייבים להיות מאוחסנות באופן מיידי על קרח יבש ולאחר מכן הועברו לטמפרטורה נמוכה במיוחד (-80 ° C) מקפיא עד חתך. חשוב לציין כי רקמות לא צריכים להסיר מהמקפיא מבלי להיות על קרח יבש, כי הקפאה, הפשרה גם לפגוע במבנה רקמה.
עוד הערה חשובה בעת ביצוע ניתוח היסטולוגית היא לטפל תמיד לנתח את אותו חלק מהרקמות של עניין כדי להבטיח אחידות בין ניתוח. ניתן לעשות זאת על ידי ביצוע חתכי שריר ניתוח midbelly. זהו החלק של השריר כי הוא עבה ולכן יהיה לי אזור החתך הגדול ביותר. על מנת להבטיח כי אתה אכן חתך midbelly, CSA הסעיפים הבאים יש למדוד באמצעות תוכנת הדמיה היסטולוגית. Measuremמציג צריך להמשיך להתבצע עד אזור החתך מתחיל רמה. ברגע שזה קורה, כבר הגיעה לאמצע הבטן; רק חלק זה של הרקמה צריך לשמש לניתוח היסטולוגית כדי להבטיח אחידות בין השוואות.
לאחר חתך הושלם ושקופיות שהוכנו, הם צריכים להיות מותר לייבוש על RT עבור 1 - 2 שעות. ייבוש מאפשר לדבקות ראויה של הסעיף לשקופית וגם מונע את עודפי מים להתגבש בעקבות העברה למקפיא -80 מעלות צלזיוס. חשוב לציין כי שקופיות צריכים גם להיות מטופלות רק על קרח יבש בעת בחירת שקופיות לניתוח כדי למנוע להקפיא להפשיר מחזורים. ברגע שקופיות שנבחרו לצביעה, פרוטוקולים כלולים עם הכתם צריך להיות ראשון ואחרי על בסיס ניסיון עד תוצאות אופטימליות הושגו. בעת ביצוע immunostaining, חשוב לעשות שקופיות בטוחים לא להתייבש לאורך כל ההליך. ייבוש של שקופיות יכול לגרום לאינטראקציה חולפתשל להישאר ללא פגע הבא דגירה. אינטראקציות אלה לא ניתן להסיר במהלך שוטף ולגרום לכתמים ספציפיים. ניתן להימנע מייבוש על ידי שמירה על שקופיות באווירת humidified. ביצוע incubations עם קטעים מכוסים parafilm ושקופיות על מגבת נייר לחה אטומה בקופסא שקופיות קטנה מספיק כדי להבטיח שקופיות לא יבשות בכל נקודה במהלך ההליך.
היסטולוגיה היא כלי חיוני בהדמית מורפולוגיה והיבטים שונים של פתולוגיה. בעוד טריוויאלי קצת, זה הוא בעל החשיבות הגדולה ביותר לטפל גדול בהכנת רקמות לשמש להיסטולוגיה. מכריתה להקפאה, חתך וצביעה, יש לטפל ברקמות באופן שימנע נזק הקפאה ויניב התמונות מדויקות ביותר אפשריות. ללא שימור נכון, מכתים לא משקף במדויק פיזיולוגיה ולכן להוביל לפרשנות שגויה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
References
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N.
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P.
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
