Maus-Modell der Alloimmune-induzierte Gefäßabstoßung und Transplantat-Arteriosklerose

Summary

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Abstract

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

Introduction

In den vergangenen mehr als 30 Jahren haben Fortschritte in der Immunsuppressiva Transplantatabstoßung aufgrund von akuten Abstoßung verringert, sondern chronische Abstoßung bleibt eine zentrale Herausforderung. Die wichtigste Manifestation der chronischen Herztransplantatabstoßung ist Transplantat-Arteriosklerose (TA) ^1,2. Dieser Zustand wird durch Intimahyperplasie und vasomotorische Dysfunktion Allotransplantat Arterien charakterisiert und entwickelt sich als Folge der immunologischen Targeting von Endothelzellen und glatte Muskelzellen des Empfängers Immunsystems. Die spezifische Ausrichtung des Transplantats Gefäßsystem durch Anerkennung ausländischer Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) ist durch die Entwicklung der TA ausschließlich im Transplantat Arterien hervorgehoben unter Schonung Wirtsgefäßen ^3. In diesem Sinne ist die Beobachtung, dass TA nicht experimentell auftreten, wenn der Empfänger genetisch identisch zu dem Spender oder wenn der Empfänger-T-Zellen und ^B-4 fehlt. Immunvermittelten Gefäßverletzung und dysfunction bewirkt, dass die Entwicklung der Intimaverdickung und Fibrose sowie die aberrant Akkumulation von Lipiden und ECM-Proteine, TA ^5. Intimaverdickung neigt während der gesamten arteriellen Baum ^4-6 konzentrisch zu sein. Graft Verlust und Tod treten in der Regel als Folge der fortschreitenden Ischämie von Lumen Verschluss der Arterien Allograft ⁴ resultieren.

Im Jahr 1991 Mennander et al. ⁷ Pionier eine Aorten Zwischenmodell bei Ratten zu Modell TA. Mehrere Gruppen haben anschließend diese Prozedur für den Einsatz in Mäusen angepasst. In diesem Modell entwickeln Allograft Aortasegmente Läsionen, die Funktionen vergleichbar mit TA in klinischen Transplantationen beobachtet haben. Dies schließt Intimaverdickung die durch die Ansammlung von glatten muskelähnlichen Zellen und Leukozyten Empfänger ^7. In den letzten 2 Jahren ist dieses Modell verwendet worden, um wichtige Einblicke in die Mechanismen der Gefäßverletzung, Ablehnung und TA zu erzeugen. Es kann unsed, Fragen an Immun- und Kreislauf-Reaktionen während arterielle Pathologie untersuchen. Die Wahl des Antigens Einstimmung beeinflusst die Fähigkeit, diese Fragen angemessen anzugehen.

Transplantation über komplette MHC Barrieren ermöglicht eine umfassende Bewertung der Immunreaktionen, die bekanntermaßen in Organtransplantatabstoßung beteiligt sein. Dies beinhaltet direkte CD4- und CD8-T-Zell-Erkennung und Ausrichtung der Fremdpeptid-MHC durch Pfropf-abgeleiteten Zellen präsentiert, indirekte CD4 (und möglicherweise CD8) T-Zell-Erkennung und Ausrichtung der Transplantat-Empfänger von abgeleiteten Alloantigene Antigen-präsentierenden Zellen präsentiert, und Antikörper- vermittelte Erkennung Alloantigene auf Gefäßzelloberflächen ^8. Jedoch kann die vaskuläre Reaktion auf eine Verletzung im vollständigen MHC-fehlangepaßt Experimenten anders als die klinisch beobachtet wird. Johnson et al. ⁹ zeigt, daß in Zwischenaortatransplantate in einem vollständigen MHC Mismatch Barriere transplantiert meistendie neointimale Zellen des Empfängers Herkunft und nicht die von Spenderursprung. Dies ist anders als in den Menschen transplantiert wird, wo die meisten der intimalen glatten Muskelzellen von Spenderursprung ^9,10 beobachtet. Um diese Einschränkung zu berücksichtigen, haben alternative Versuchsmodellen, die über kleinere Histokompatibilitätsantigen Mismatches Pfropfen beinhalten entwickelt, die Gefäßreaktionen, die mehr ähneln denen in der klinischen Transplantation ¹¹ beobachtet auslösen. Während diese alternative Modelle erlauben wichtige Rückschlüsse auf den Gefäßreaktionen, die die Entwicklung der TA, die immunologischen Prozesse, die vaskuläre Abstoßung in kleinere Histokompatibilitätsantigen mismatched Transplantate verursachen nicht komplett neu kapitulieren solche, die in der klinischen Einstellung auftreten fahren hergestellt werden. Zum Beispiel sind Nebenhistokompatibilitätsantigene schlecht von Transplantat reaktive Antikörper ¹² erkannt. Angesichts der vorstehenden Erwägungen ist es wichtig, die pathologische questi betrachtenon untersucht bei der Auswahl der Art des Antigens Fehlanpassung in einem aortischen Zwischenmodell verwendet. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Maus-Aortazwischen Pfropfen. Wir beschreiben Zwischen Pfropfung zwischen vollständigen MHC-fehlgepa Mäusen, aber das gleiche Protokoll wird für die Transplantation in andere Antigen mismatched Mausstämme verwendet.

Protocol

Alle Protokolle in dieser Studie wurden überprüft und von der Simon Fraser University Tierpflege Ethik-Kommission genehmigt. Verwenden Balb / CYJ (H2 d) Spendermäusen und C57BL / 6 (H2 b) Empfängermäuse zu allogenen Reaktionen zu untersuchen. Mäuse werden für Experimente im Alter von 8 bis 12 Wochen zwischen verwendet. Verwenden Sie entweder weiblichen oder männlichen Mäusen. Syngenen Kontrollen bestehen aus Aortasegmente von C57BL / 6-Geber in C57BL / 6-Empfänger. 1. Spender und Em…

Representative Results

In diesem Modell wird die Bauchaorta, die von einer Balb / CYJ Maus in der infrarenalen Aorta einer C57BL / 6-Empfänger angeordnet ist. Dies ermöglicht eine umfassende Bewertung der Alloimmune Reaktionen, Transplantat Arterien Ziel. Immunvermittelte Gefäßverletzung in diesem Modell initiiert Gefäß reparative Antworten, die in Verdickung der Intima, Lumeneinengung und die Rekrutierung von Immunzellen gipfeln (Abbildungen 1 und 2). Diese Kriterien dann als Auslese für die Schwere d…

Discussion

Wir haben ein Protokoll für Aorten Zwischen Pfropfung bei Mäusen, die zur Untersuchung von immunvermittelten Gefäßabstoßung und TA beschrieben. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Ursachen der TA als auch die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu untersuchen. Es hat in der Vergangenheit verwendet, um eine wesentliche Rolle der adaptiven Immunität, zytotoxische T-Zellreaktionen, Zytokin-vermittelte CD4 T-Zell-Effektor-Reaktionen und Antikörper-vermittelte Transplantatschäden TA ^{14,17-21</su…}

Materials

Name	Company	Catalogue	Comments
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	Strain# 000664
Balb/cBYJ	Jackson Laboratories, Bar Harbour ME	Strain# 001026
Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ mL	Ketalean	DIN 00612316
Xylazine Injection 20 mg/mL	Rompum	DIN 02169592
Ketoprofen Injection 100 mg/mL	Anafen	DIN 01938126
Butorphanol Tartrate injection 10 mg/mL	Torbugesic	DIN 008450000
Buprenorphine Injection 0.3 mg/mL	Reckitt Benckiser	B.N. 5241
Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution	Antisedan	DIN 02237744
Heparin Sodium Injection, USP, 1000 units/mL	McKesson Distribution	DIN 02264315
Tears naturale ophthalmic ointment	Alcon	DIN 02082519
Stereomicroscope	Leica	M80
0.9% Sodium Chloride, sterile	Baxter Corporation
Lactated Ringer’s solution, sterile	Baxter Corporation
0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 mL	Baxter Corporation
Alcohol Prep Pads	Loris
Povidone Iodine	Betadine
Chlorohexidine Gluconate 4% w/v	Germi-Stat
Black Polyamide Monofilament	AROSurgical Instruments	T4A10Q07
Suture, 10-0 suture, 70 microns	Corporation
Blue monofilament suture 5-0, P3 needle	Ethicon	8698G
1 ml Syringe	BD	REF 309659
10 ml Syringe	BD	REF 309604
1cc TB insulin syringe with 28G 1/2	BD	REF 309309
25G 7/8, hypodermic needle	BD	REF 305124
27G 1/2, hypodermic needle	BD	REF 305109
Colibri Retractor- 1.5cm spread 4cm	Fine Science Tools	17000-04
S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock	Fine Science Tools	00072-14
Supergrip forceps, S&T	Fine Science Tools	00632-11
Medical No.5 forceps	Fine Science Tools	11253-20
Lexer Baby Scissors	Fine Science Tools	14078-10
Micro Adson forceps serrated	Fine Science Tools	11018-12
Vannas-Tubingen microscissors	Fine Science Tools	15003-08
Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length	Fine Science Tools	00396-01
Graefe-forceps, 10cm 1×2 teeth	Fine Science Tools	11054-10
Castroviejo with lock and tungsten jaws	Fine Science Tools	12565-14
Hot glass bead sterilizer	Inotech 250	IS-250 – Steri-250
Non-woven gauzes	Progene
Cotton Tipped Applicators	Puritan
Beard Trimmer	Wahl
Heating pad	Sunbeam