This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.
Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.
I microrganismi sono onnipresenti e svolgono ruoli essenziali nel cicli biogeochimici della Terra 1. Attualmente, ci sono numerosi approcci molecolari disponibili per caratterizzare la struttura comunità microbica e funzione. Più comune è l'analisi del gene 16S rRNA sequenze PCR-amplificato dal DNA ambientale 2-4. Uno svantaggio di analisi del gene 16S rRNA è che fornisce solo informazioni sull'identità filogenetica e struttura della comunità, con poche informazioni sulla funzione metabolica. Al contrario, approcci come metagenomica, metatranscriptomics e metaproteomica forniscono informazioni sulla struttura delle comunità e il metabolismo. Metagenomica o l'analisi del contenuto gene di un assemblaggio di organismi, fornisce informazioni sulla struttura e potenzialità funzionali della comunità 5 – 8. Anche se potente, questo potenziale funzionale potrebbe non corrispondere al metabolicaattività degli organismi. Genotipo di un organismo è rappresentata dai suoi geni, ognuno dei quali può essere trascritto RNA e in seguito tradotti alla proteina, causando un fenotipo. Così, per aiutare nella comprensione della attività funzionale microbica in un ambiente, l'analisi post-genomica deve essere eseguita 9. Metatranscriptomics, o l'analisi dei trascritti di RNA è utile perché rivela quali geni sono trascritti in un determinato ambiente. Tuttavia, i livelli di mRNA non sempre corrispondono ai livelli di proteina corrispondente a causa di regolazione traduzionale, RNA emivita, e il fatto che più copie della proteina possono essere generati per ogni mRNA 10.
Per questi motivi metaproteomica è ormai riconosciuta come un importante strumento per microbiologia ambientale. Metaproteomic comune analizza utilizzare un approccio di proteomica fucile da caccia dove la serie completa nei pressi di proteine in un campione complesso sono purificati e analizzati allo stesso tempo, di solito attraverso itdigestione enzimatico in peptidi e analisi su uno spettrometro di massa. Spettrometria di massa tandem successivo (MS / MS) "peptide fingerprinting" è utilizzato per determinare la sequenza di peptidi e proteine di origine potenziale da database di proteine ricerca (per una rassegna vedi 11). Lavoro proteomica ha fatto molta strada negli ultimi 25 anni grazie all'aumento di genomica disponibilità dei dati e l'aumento della sensibilità e la precisione di spettrometri di massa che consentano l'identificazione di proteine ad alto rendimento e la quantificazione 11,12. Poiché le proteine sono il prodotto finale di espressione genica, i dati metaproteomic può aiutare a determinare quali organismi sono attivi in un determinato ambiente e quali proteine stanno esprimendo. Questo è vantaggioso quando si cerca di determinare come un particolare insieme di variabili ambientali influenzerà il fenotipo di un organismo o di una comunità. All'inizio, gli studi metaproteomic basate su MS MS / nell'oceano sono stati usati per identificare le proteine specifiche in miratalignaggi microbici, con il primo studio incentrato sulla luce guidato protonica pompa proteorodopsina in SAR11 batteri marini 13. Più di recente, le analisi comparative metaproteomic hanno chiarito pattern di espressione proteica differenziali tra le comunità complesse. Gli esempi includono l'identificazione di variazioni temporali nel metabolismo del litorale nord-occidentale dell'Oceano Atlantico 14 o la Penisola Antartica 5. Altri studi hanno descritto variazioni dei pattern di espressione proteica attraverso scale spaziali, ad esempio, lungo un transetto geografica da un oceano bassa nutrienti gyre ad un sistema upwelling costiero altamente produttivo 15. Per ulteriori recensioni di metaproteomica si consiglia Schneider et al. (2010) 9 e Williams et al. (2014) 16. Proteomica mirate sono stati anche impiegati negli ultimi anni per quantificare l'espressione di specifiche vie metaboliche nell'ambiente 17,18.
There sono tre fasi principali nell'analisi metaproteomic. La prima fase è la preparazione del campione, che comprende la raccolta del campione, la lisi cellulare e la concentrazione di proteine. Raccolta dei campioni in microbiologia marina spesso comporta la filtrazione di acqua marina attraverso un pre-filtro per rimuovere le cellule eucariotiche grandi, particelle e batteri particelle-associata, seguita da filtrazione per la cattura di cellule microbiche vivere liberi, comunemente con l'uso di una cartuccia di 0,22 micron unità filtro 19,20. Questi filtri sono incased in un cilindro di plastica e una lisi cellulare e protocollo di estrazione proteina che può essere effettuata all'interno del gruppo filtro sarebbe uno strumento prezioso. Una volta ottenuta la biomassa, le cellule devono essere lisate per consentire l'estrazione delle proteine. Diversi metodi possono essere impiegati, compresi guanidina-HCl 21 lisi e sodio dodecil solfato (SDS) metodi basati lisi. Anche se i detersivi come SDS sono molto efficienti a distruggere le membrane e solubilizzando molti tipi di proteine, Concentrations partire da 0,1% a valle può interferire con la digestione delle proteine e MS analisi 22. Di grande preoccupazione è gli effetti negativi della SDS su tripsina efficienza digestione, potere risolutivo della retromarcia cromatografia liquida fase e soppressione ionica o l'accumulo all'interno della sorgente di ioni 23.
La seconda fase è frazionamento e analisi, in cui le proteine vengono sottoposti a digestione enzimatica seguita da analisi LC MS / MS, conseguente am / z modello frammentazione che può essere utilizzata per determinare la sequenza amminoacidica primaria del peptide triptico iniziale. Vari metodi di digestione può essere eseguita a seconda delle tipologie di detergenti utilizzati, nonché il workflow spettrometria di massa a valle. Nel nostro protocollo, 1-D elettroforesi PAGE seguita dalla rimozione di SDS dal gel viene utilizzato per eliminare eventuali contaminazioni detergente. L'analisi delle proteine che sono difficili da solubilizzare, come le proteine di membrana, richiede l'uso di alta concenzioni di SDS o altri detergenti. Questo porta a problemi di compatibilità con elettroforesi SDS-gel. Se l'obiettivo di uno studio richiede la solubilizzazione di questi difficile da solubilizzare le proteine, il sistema tubo-gel può essere usato 22,24. Il metodo del tubo-gel incorpora proteine all'interno della matrice gel senza l'uso di elettroforesi. Successivamente detergenti utilizzati per la solubilizzazione vengono rimossi prima di digestione delle proteine.
La terza fase è l'analisi bioinformatica. In questa fase i dati peptidici MS / MS vengono ricercati con un database di sequenze nucleotidiche tradotti per determinare quali sono presenti nel campione peptidi e proteine. L'identificazione di peptidi dipende database viene ricercato contro. Dati metaproteomic marini sono comunemente cercati nei database costituiti da genomi di riferimento, dati metagenomiche come il set di dati Global Ocean Sampling 25, così come cellulari amplificati genomi singoli da li incoltoneages 26,27. L'identificazione delle proteine può essere aumentato anche l'inclusione di sequenze metagenomiche dallo stesso campione come dati metaproteomic stato derivato 5.
Qui forniamo un protocollo per la generazione di peptidi adatti per l'analisi MS MS / da biomassa microbica raccolti per filtrazione e memorizzati in una soluzione di stabilizzazione RNA. Il protocollo qui descritto permette di DNA e proteine per essere isolati dallo stesso campione in modo che tutte le fasi che portano alla proteina e precipitazioni DNA sono identici. Dal punto di vista pratico, meno filtrazione è necessaria poiché solo filtro è necessario per proteine e estrazione del DNA. Vorremmo anche riconoscere che questo protocollo è stato creato attraverso la combinazione, l'adattamento e la modifica di due protocolli precedentemente pubblicati. I passi lisi cellulare sono adattati da Saito et al. (2011) 28 e la tripsina in-gel digerire componente è adattato da Shevchenko et al. (2007) 29.
Conservazione del campione è fondamentale per gli studi metaproteomic e lavoro precedente ha dimostrato che una soluzione di stabilizzazione RNA è un buffer di archiviazione utile per conservare le cellule prima dell'estrazione delle proteine 28. Idealmente, i campioni dovrebbero essere conservati in situ di negare cambiamenti nell'espressione delle proteine durante la movimentazione 33,34. Infatti, in situ sono state sviluppate tecnologie di campionamento e …
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.
Sterivex -GP 0.22 μm filter unit | Millipore | SVGP01050 | Sampling |
RNAlater Stabilization Solution | Ambion | AM7021 | Sampling |
Tris | Bio Basic | 77-86-1 or TB0196-500G | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | Protein Extraction |
SDS | Bio Basic | 15-21-3 | Protein Extraction/ SDS PAGE gel |
EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | Protein Extraction |
Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | Protein Extraction |
10K Amicon Filter | Millipore | UFC801024 | Protein Extraction |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | Protein Precipitation |
Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | Protein Precipitation |
MPC Protein Precipitation reagent | Epicenter | mmP03750 | DNA Precipitation |
2-Propanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | DNA Precipitation |
Qubit dsDNA BR Assay kit | Life Technologies | Q32850 | DNA Quantification |
Qubit Protein Assay kit | Life Technologies | Q33211 | Protein Quantification |
Sucrose | Bio Basic | 57-50-1 | SDS PAGE gel |
TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE gel |
APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE gel |
30% Acrylamide | Bio Rad | 161-0158 | SDS PAGE gel |
SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE gel |
Glycine | Bio Rad | 161-0718 | SDS PAGE gel |
B-mercaptoethanol | Bio Basic | 60-24-2 | SDS PAGE gel |
Laemmli Sample Buffer | Bio Rad | 161-0737 | SDS PAGE gel |
Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder | Bio Rad | 161-0375EDU | SDS PAGE gel |
Acetonitrile | VWR | CABDH6044-4 | In-gel Trypsin digest |
NH4HCO3 | Bio Basic | 1066-33-7 | In-gel Trypsin digest |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632-1G | In-gel Trypsin digest |
Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500ML | In-gel Trypsin digest |
HPLC grade H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | In-gel Trypsin digest |
Iodoacetamide | Bio Basic | 144-48-9 | In-gel Trypsin digest |
Trypsin | Promega | V5111 | In-gel Trypsin digest |
Protein LoBind Tube 1.5ml | Eppendorf | 22431081 | In-gel Trypsin digest |
2mL ROBO vial 9mm | Candian Life Science | VT009/C395SB | In-gel Trypsin digest |
PP BM insert, No spring | Candian Life Science | 4025P-631 | In-gel Trypsin digest |