Introduction
Målet med denna artikel är att i detalj beskriva en metod för att generera och karaktärisera humana IgG monoklonala antikroppar erhållna från humana perifera mononukleära blodceller (PBMC).
Intresset för att studera humana antikroppar har vuxit i många olika forskningsområden. I synnerhet många forskargrupper är intresserade av patologin orsakas av autoantikroppar 1-3. Vi har klonats och karakteriserats patogena autoantikroppar 1. Studiet av autoantikroppar kan bidra till att identifiera sina mål och att utveckla terapeutiska strategier, t.ex. med hjälp av konkurrerande antikroppar 4. Dessutom kan studier av humana antikroppar också vara av intresse för andra forskningsområden, det vill säga, att utvärdera immunsvaret efter vaccination 5, för att karaktärisera antikroppsprofil av individer som exponerats och blev resistenta mot specifika patogener 6 eller att studera vilka antikroppar iden naturliga repertoaren 7,12.
Flera tekniker har utvecklats för att generera rekombinanta humana monoklonala antikroppar 8-12; de flesta av dessa använder fagpresentation och B-cellsodödliggörande. Användningen av fagpresentation har använts i stor utsträckning för upptäckten av nya antikroppar 13. Den har emellertid en stor nackdel, nämligen att de tunga och lätta kedjepar av det humana immunglobulinet bli dissocierade i processen. Produktion av hybridom med humana B-celler eller EBV-transformation övervinner denna nackdel.
Vi använder infektion av tymiska B-celler med EBV i kombination med polyklonal B-cellstimulering via Toll-like receptor 9 (TLR-9) 6,12.
I detta dokument beskriver vi i detalj teknik som vi använder för utveckling av IgG humana antikroppar, med en fullständig överblick över alla steg från PBMC isolering till in vitro generationen antikroppen i. DettaProtokollet kan användas för analys av vilken som helst typ av humant IgG-profil. I vårt laboratorium, har B-celler som producerar IgG-antikroppar med framgång är skild från resten av PBMC efter sortering. Femtio sorterade B-celler 8 kan därefter pläteras i flerbrunnsplattor och immortaliseras genom EBV och TLR-9-aktivering, för den klonala expansionen av enskilda B-celler. Som matarceller, har fibroblaster från human embryolungvävnad har använts, cellinje WI38, vilket underlättar visualisering av de odödliggjorda B-celler. Från dessa B-celler, kan sekvenserna för de tunga och lätta kedjorna av immunglobulin kan erhållas genom PCR, och antikropparnas generna som klonats i immunglobulin G expressionsvektorer och producerade in vitro. Med denna teknik kan studeras enskilda antikroppar med exakt samma antikropp sekvens som återfinns i givaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Informerat samtycke erhölls från deltagarna i studien. Studien godkändes av institutionella etiska kommittén.
1. Isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC)
- Centrifug 25 ml av deltagarnas hepariniserat blod vid 900 xg under 15 minuter, så snart som möjligt efter utvinning blod. Om det finns mindre blod, skala ner reagenserna därefter. Utför alla nästa steg i en huva.
- Överför serumet till ett rent rör. Den kan användas i senare steg för frysning PBMC eller i fall av autoimmuna patienter, för att testa autoantikroppar.
- Späd blod med 10 ml RPMI 1640 medium och återsuspendera cellerna genom pipettering upp och ned.
- Tillsätt 15 ml av en lösning innehållande polysackaros och natrium diatrizoat (1,077 g / ml) till en ny 50 ml tub.
- Skikt försiktigt på blod på toppen av lösningen i steg 1,4 genom att bringa de båda öppningarna i rören nära togethenne tills de två vätskorna kommer mycket långsamt i kontakt, och sedan dekantera PBMC-suspensionen sakta ovanpå 50 ml röret. Detta steg är viktigt att ha en god separation av PBMC.
- Centrifugera röret som erhållits i steg 1,5 vid 400 xg utan broms vid RT under 20 minuter.
- Efter centrifugering, återhämta med pipett den vita ringen som visas i den mellersta delen av röret, som innehåller PBMC.
- Tvätta cellerna med 25 ml RPMI 1640 medium.
- Centrifugera 300 xg vid RT under 10 minuter.
- Kasta bort vätskefasen och tvätta cellerna med 10 ml RPMI 1640. Centrifugera igen som i steg 1.9.
- Räkna PBMC med en Neubauer kammare som tidigare rapporterats 14.
- Bearbeta PBMC som i avsnitt 2 eller lagra dem för senare användning enligt följande: 10 miljoner PBMC för frysning per cryovial rör utspädd i 1 ml 10% dimetylsulfoxid (DMSO) och 90% serum som erhållits i steg 1.2. Frys progressivt och för lång stoilska i flytande kväve.
2. Färgning PBMC för Sortering CD22 + och IgG + av Cell Cytometry
- Plate PBMC i en 25 cm 2 cellodlingskolv med 6 ml fullständigt RPMI 1640-medium (kompletterat med L-glutamin, 10 mM HEPES-buffert, 50 U / ml penicillin, 50 | ig / ml streptomycin och 10% fetalt bovint serum) och låta dem återvinna O / N i inkubatorn vid 37 ° C vid 5% CO2.
- Blockera sterila FACS rör med steril 4% albumin fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning O / N. Tvätta rören två gånger med PBS och fylla dem med 500 ^ il fullständigt RPMI 1640-medium. Använd dessa tuber för att återvinna cellerna efter sortering.
- Samla PBMC i ett rör och centrifugera vid 400 xg vid RT under 5 minuter.
- Resuspendera cellerna i buffert märkning (se steg 2,5 och 2,6) och räkna dem 14. Buffert Märkningen är steril 2% fetalt bovint serum och 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i PBS.
- Förbered tre fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) rör med 10 5 celler var och återsuspendera dem i 100 | il buffert märkning. Dessa rör kommer att tjäna för att definiera portar sorteringen.
- I det första röret till 5 pl av anti CD22 PerCP antikropp (som rekommenderas i tillverkarens datablad), i det andra röret 20 | il av anti-IgG-PE (som rekommenderas i tillverkarens datablad), och ingenting i det tredje röret. Inkubera på is och i mörker under 30 minuter.
- Resuspendera 5 miljoner celler i 200 pl buffert märkning i en FACS rör och tillsätt 10 pl av anti CD22 PerCP och 40 pl anti-IgG PE. Inkubera cellerna på is och mörker under 30 minuter. Om sortering av ett större antal celler önskas, skala upp alla reagensen.
- Centrifugera cellerna vid 400 xg med låg broms för 5 min vid RT.
- Dekantera försiktigt supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 500 μl buffert märkning. Centrifugera cellerna vid 400 xg med låg broms för 5 min vid RT. Upprepa steg 2,7 och 2,8
- Dekantera försiktigt supernatanten och suspendera cellerna i 300 pl RPMI komplett medium.
- Passera cellerna genom ett 0,45 pm filter. Cellerna är redo att sortera.
3. Sortering av B-celler CD22 + och IgG +
- Använd 3 kontrollrören att fastställa cellernas viabilitet. I kontrollrummet med ingen färgning, använd den främre och storlek punktdiagram för att definiera lymfocyter grind. Kontrollerna med CD22 PerCP och anti-IgG PE tjänar till att fastställa grindarna och sorteringsgrinden. Utför följande tidigare rapporterade uppgifter 15.
Obs: En grind är en uppsättning av värdegränser (gränser) som tjänar till att isolera en specifik grupp av cytometrisk händelser, i vårt fall celler, från en stor uppsättning. I fallet med en sorteringsgrind värdegränserna tillåter återvinning av cytometrisk händelser, celler, som är inne igränserna definierade: CD22 + och IgG +. - Som en samling rör vid hanteringen, använd de blockerade rör med 500 pl komplett RPMI 1640-medium, som erhållits från steg 2.2.
- Fortsätt att sortera dubbelt positiv 15: CD22 + IgG +. Notera det slutliga antalet celler i varje tillstånd. Plattan sorterade celler på toppen av matarceller så snart som möjligt.
4. Bestrålning av matarceller
Obs: Utför framställning av matarceller mellan 1 - 3 dagar före sortering. Minst 5000 WI38 celler behövs per brunn i en 96 rund brunnar. Utför steg 4.1, 4.2 och 4.4 i en huva.
- Odla WI38-celler vid 37 ° C och 5% CO2 i fullständigt RPMI 1640-medium (samma som för PBMC) tills det önskade antalet cell uppnås.
- Bestråla dem på 50 Grays, efter ett protokoll beskrivits tidigare 16. Utför bestrålning när WI38 cellerna har trypsiniserades och återsuspenderades i complete RPMI-medium, eller med WI38 bifogas odlingskolven och trypsinerades efter bestrålningen. Följ metod för trypsinization anges av leverantören av WI38-celler. Bestråla antalet celler som krävs för att täcka brunnarna som behövs för plätering IgG + B-celler (1% av den totala PBMC räknas i steg 1,11).
- Plattan 90 fil innehållande 5000 bestrålade WI38-celler i varje brunn i 96 runda brunnar. Lämna brunnarna i utanför raden av plattan tom (eftersom de avdunstar snabbare), och endast använda de 60 brunnarna i mitten av plattan för plätering celler. Fyll de yttre brunnarna som inramar plattan med 200 ul PBS.
- Placera dem i en inkubator vid 37 ° C vid 5% CO2, tills det behövs.
5. Plating Sorterat PBMC, EBV-infektion och Växande
- Späd de sorterade PBMC, till plattan 50 celler i 50 | il RPMI 1640 komplett medium per brunn i 96 runda brunnar (tidigare pläterad intelligensh WI38 bestrålade celler). Utför steg i en huva utrustad för EBV arbete.
Anm: infektionen av 50 celler per brunn är optimerad och ökar likehood att producera en monoklonal antikropp 8, är det emellertid rekommenderat att verifiera detta genom PCR såsom beskrivits tidigare 1,6. - Lägg 60 pl av EBV-supernatant (innehållande 3-4 x 10 8 virala kopior / ml) till varje brunn i 96 runda brunnar 17. Försiktighet bör iakttas vid EBV arbete.
- Lägg ett pg / ml CpG (ODN2006) per brunn.
- Lämna cellerna i en inkubator vid 37 ° C vid 5% CO2.
- Visuellt övervaka klon odlas under mikroskop efter en vecka.
Obs: Några exempel på B-celltillväxt kan ses nedan i avsnittet resultat. Lägg märke till att tillväxttakten för klonerna kan variera, och extra tid kan vara nödvändigt att börja se några cellmassa växer i mitten av brunnen. - Efter den 1 två veckors bildskärm klon växer under ljusmikroskop och gå vidare till den första mediautbytet. Långsamt pipettera 90 ul av mediet från den övre delen av brunnen och samla i en ren 96-brunnsplatta. (B-celler ligga i botten av brunnen, så det finns ingen risk för att aspirera dem).
- Tillsätt till varje brunn 100 | il fullständigt RPMI 1640-medium kompletterat med 1 | ig / ml av CpG (ODN2006) och 50 U / ml IL2. Om kloner växer, analysera denna första media utbyte av ELISA som i steg 6.
- Övervaka klon växande och ändra media efter 3: e och den 4: e veckan av växer igen genom att ta 90 | il medium och tillsats av 100 | il fullständigt RPMI 1640-medium kompletterat med 1 | ig / ml av CpG (ODN2006) och 50 U / ml av IL2. Använd den insamlade supernatanten att övervaka IgG-produktion genom ELISA såsom i steg 6.
Obs: Efter en månad klon växer bör vara uppenbart genom att observera aggregat av runda celler that ligger vanligtvis i mitten av den rundbottnade brunn. - I detta steg, ändra media på samma sätt som de senaste veckorna, men endast med komplett RPMI 1640-medium. En bra indikator för att veta rätt tillfälle att ändra media är media färg, om det blir gulaktiga celler behöver en mediautbyte.
- När 96-brunnars plattor innehållande stora kloner (cirka 5 x 10 5 celler), överföra dem till en platt brunn i en 24-brunnsplatta. Tillsätt 300 pl av kompletta RPMI 1640 media till den nya brunnen. Resuspendera 96 brunnar växande klon, genom att pipettera upp och ned flera gånger, och överföringsceller till den nya brunnen, distribuerar homogent. Lägg till nya medier när det behövs.
- När brunnar i 24-brunnar är fulla av celler (cirka 5 x 10 6 celler), överför till en platta brunn i en 6-brunnar. Lägg 2 ml fullständigt RPMI 1640 media till nya brunnen. Resuspendera cellerna i 24-brunnsplatta genom att pipettera upp och ned flera gånger, och distribuera dem homogedigt i den nya brunnen.
- Lägg till media när det behövs. Om celler inte upprätthållas i kultur, pellets cellerna vid 400 xg under 5 minuter vid RT. Förvara supernatanterna för ELISA-testning. Tvätta pellet av cellerna en gång med 1 X PBS, centrifugera igen vid 400 xg under 5 minuter, och förvarades torrt vid -80 ° C tills RNA-extraktion.
- När cellerna i 6-brunnar blir sammanflytande (ca 20 x 10 6 celler), överför till en 60 mm odlingsplatta. Lägg 4 ml fullständigt RPMI 1640 media till den nya plåten. Resuspendera cellerna i 6-brunnar och överföra dem som gjort är steg 5,9 och 5,10.
- Lägg till nya medier när det behövs. I detta steg, frysa celler vid 10 till 30.000.000 / ml i 90% fetalt kalvserum och 10% DMSO. Om större mängder celler ville fortsätta expansionen av klonerna i större ytplattoma.
6. ELISA för IgG-antikropp Detection
- Dispensera 50 | il / brunn i en ELISA-platta of get F (ab) 2 anti-human Fc-antikropp utspädd 1 200 i beläggningsbuffert. Beläggningsbuffert innehåller 50 mM Na 2 CO 3 pH 9,6.
- Förslut plattorna med en plast klistermärke, och inkubera 1 timme vid 37 ° C. Alternativt, inkubera vid 4 ° CO / N.
- Tvätta varje brunn sex gånger med 200 ul av tvättbuffert. Tvättbuffert innehåller 0,05% Tween-20 i 1 X PBS. Rör inte eller repa väl yta där antikroppen har bundit.
- Blockera med blockeringsbuffert, 100 | il / brunn. Blockeringsbuffert innehåller 4% av fettfri torrmjölk i PBS. Förslut plattan och inkubera 1 timme vid 37 ° C.
- Ej vattentvätt. Kassera blockerande buffert och smetar de plattan tre gånger upp och ner på en pappershandduk för att avlägsna kvarvarande vätska.
- Inkubera kloner "supernatanterna och standarder.
- För ett första test, späd klon supernatanter som erhållits i steg 5.6 eller 5.7 1/3 i RPMI. För standarderna späd med RPMI-medium humant IgG-lösning för att få: 1000 ng /ml, 500 ng / ml, 250 ng / ml, 125 ng / ml, 62,5 ng / ml, 31,25 ng / ml, 15,6 ng / ml och tomt. Använd 50 | il / brunn och inkubera vid 37 ° C under 60 minuter. Analysera ytterligare utspädningar av klonen "vätskan för att testa antikroppen affinitet, såsom 1/10 eller 1/100.
- Tvätta som görs i steg 6.3.
- Använd 50 | il / brunn av get-F (ab) 2 anti-humant IgG Fc-peroxidaskonjugerat utspätt 1: 20,000 i inkubationsbuffert. Inkubationsbuffert innehåller 1% BSA och 0,02% Tween 20 i 1 x PBS. Inkubera vid 37 ° C under 60 minuter.
- Tvätta som görs i steg 6.3.
- Lägg 100 pl / brunn substratlösning innehållande 0,1% 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB). Inkubera 10 min tills en stabil blå färg former i brunnarna. Var försiktig; vänta inte för länge!
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 50 | il 2 MH 2 SO 4. Mät absorptionen vid 450 nm, inom 30 min efter det att reaktionen stoppats.
Notera: Alla klonerna supernatants med 3 standardavvikelser över ämnet kommer att vara positivt för IgG-humana antikroppar. För bekräftelse av de positiva klonerna denna ELISA bör upprepas minst tre gånger i olika supernatanter av samma klon. Också att göra risken för ospecifika korsreaktivitet rekommenderas för att säkerställa att det inte finns någon signal när supernatanterna inkuberas i obelagda men blockerade brunnar. I detta steg, att en detektionsanalys screena för kan göras antigen specificitet antikropparna av intresse före gå vidare till avsnitt 7.
7. RNA-isolering och First Strand cDNA syntes av de producerande IgG Clones
- Så snart som produktionen av IgG bekräftas genom ELISA, extrahera RNA från klonen.
- För att extrahera RNA från celler som växer i steg 5,7 eller 5.9, använd upphöjd III celler direkt cDNA syntes kit, som gör det möjligt att erhålla DNA från 10.000 celler till en cell.
- För att extrahera RNA från larGER mängder celler, eller från pelleten lagrades i steg 5,11 använda höga rena RNA-isoleringskit. Andra system för RNA-extraktion kan också vara lämpliga i detta steg. Följ tillverkarens instruktioner.
- För cellantal mellan 1 x 10 6 och 1 x 10 4 användning omvänd transkriptionssystem, att följa instruktionerna från tillverkaren. Andra system för första sträng cDNA-syntes kan också användas.
8. 1: a och 2: a PCR för amplifiering av de tunga och lätta kedjorna av IgG-producerande B-cellkloner
- Med cDNA av cellkloner, erhållna i steg 5,6 och 5,7 och positiva i IgG-ELISA i steg 6, utföra PCR med primrar som anges i tabell 1.
- Inrätta oberoende PCR för varje IgG tung, kappa och lambda-kedjan. Gör en stamlösning med framåt- och bakåtriktade primrar i lika koncentrationer. Lägg dem till reaktionen vid 0,4 | iM slutlig koncentration. </ Li>
- Använd 1 ìl av cDNA-syntes att utföra 1 ST PCR. Här utför 20 il reaktioner använder Takara Taq tillverkarens anvisningar. Alternativt kan du använda andra polymeraser.
- Placera en m-PCR under följande cykelbetingelser: 94 ° C under 5 min; (50 cykler av: 94 ° C under 30 sekunder, 58 ° C under 30 sekunder och 72 ° C under 45 sekunder, 72 ° C under 7 minuter, låt svalna vid 4 ° C.Include en tomt i reaktionen, att upptäcka eventuella föroreningar.
- Förbered 1x TBE (89 mM Tris-borat och 2 mM EDTA). I en volym av 100 ml 1x TBE lägga en g agaros (1% agarosgel). Värm lösningen i mikron i ca 1 minut, tills agarosen blir upplöst. Lägg sedan till 4 il 10 mg / ml etidiumbromid (eller motsvarande DNA-färgämne) och blanda.
- Häll innehållet i ett fack och vänta tills får polymeriseras. Kör 5 ul av PCR-blandningen i gelén för att visualisera banden. Tung kedja-fragmentets bör vara cirka 400-550 bp, medan den lätta kedjan bör vara cirka 300-400 bp. Om banden inte upptäcks, fortsätter också att 2: a PCR.
- Använd 1 il av den första PCR-blandning för att utföra 2: a PCR. Använd samma reagens som i steg 8.2, men med hjälp av lämplig blandning av primers (se tabell 1). För de 2: a PCR använda följande betingelser: 94 ° C under 5 min; (50 cykler av: 94 ° C under 30 sek; 56,5 ° C under 30 sek och 72 ° C under 55 sek); 72 ° C under 7 minuter; låt den svalna vid 4 ° C. Inkludera en tomt i reaktionen, för att upptäcka eventuella PCR föroreningar.
- Bered en agarosgel såsom beskrivits i 8.5. Kör gelen att visualisera PCR-produkten som i 8.5.1 Använd förstärkningarna som innehåller rätt storlek fragment för kloning i steg 9 och producera antikroppar i steg 10.
- Sekvens DNA, genom användning av 10 | il reaktion innehållande: 100 ng av det 2: a PCR, 0.2 pM av primern eller tändämnesblandningen, 1 pl av terminatorn och en fil av bufferten. Utför sekvenseringsreaktionen under dessa betingelser: (25 cykler av: 96 ° C under 10 sek; 50 ° C under 5 sekunder, och till 60 ° C under 4 min); 60 ° C under 7 minuter; låt den svalna vid 4 ° C.
- Rena sekvenseringsreaktionerna med Micro G50 kolumnerna följande tillverkarens instruktioner. Utvärdera sekvenserna för ligeringen i en automatisk sekvens analysator såsom beskrivits tidigare 18. Elektroferogram bör vara rena och motsvarar en enda immunglobulinsekvens.
Obs: Om PCR-produkterna visar otydliga eller blandade immunglobulinsekvenser, kan du överväga att klona dem med TopoTA systemet, för att erhålla isolerade sekvenser och sedan vidare till steg 9.
9. Kloning och sekvensering av den tunga och lätta kedjor av de producerande IgG-kloner
- Bered 1 mikrogram av DNA vektorer pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-HL2 och pFUSEss-Chig-HG1.
- Smälta dessa vektorer med lämpliga restriktionsenzymer. Använd Eco RI och Bsi WI för pFUSE2ss-CLIg-hk, Eco RI och Avr II för pFUSE2ss-CLIg-HL2, och Eco RI och Nhel för pFUSEss-Chig-HG1. Använd 3 enheter av varje restriktionsenzym för 1 mikrogram av DNA från vektorn.
- Smälta med en enzym och rena den digere produkt med en PCR Purification Kit. Digerera med det andra enzymet och rena med en Gel Extraction Kit (enligt tillverkarens protokoll). Skär fragmentet av intresse från agarosgelen. Bered agarosgel som i steg 8,5.
- Digest 2: a PCR-produkter av den producerande IgG-klon: Eco RI och Bsi WI för kappa kedja förstärkning, Eco RI och Avr II för lambdakedja förstärkning, och Eco RI och Nhel för tung kedja förstärkning. Smälta med en enzym och rena den digere produkten med en PCR Purification Kit. Digerera med det andra enzymet och rena den digere produkt med en PCR Purification Kit. Använd samma enhet av enzymer och DNA-mängd som i steg 9.2.
- Ligera PCR-fragmenten insidan av vektorerna med T4 DNA-ligas 16 ° CO / N följande tillverkarens rekommendationer. Förhållandet som används bör vara 1: 2 (vector: insats).
- Använd 1 pl av ligering för att transformera DH5a bakterier. Följ DH5a tillverkarens villkor för transformation. Sprid bakterier i blasticidin eller zeocin plattor, beroende på vilken typ av vektor som används. Inkubera plattorna O / N vid 37 ° C.
- Väx enstaka kolonier, och extrahera DNA med en miniprep kit, enligt tillverkarens instruktioner. Används för enstaka koloni växa och DNA-extraktion tillverkarens, rekommendationer från DNA-miniprep kit. Analysera dem genom digestion med enzymer som används för framställning av vektorer och insatser som i steg 9.2 och 9.3.
- Sekvens DNA genom using 100 ng av vektorn som utförd i steg 8,8 och 8,9.
10. Produktionen av antikroppar i HEK-celler
- Väx HEK-celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 1% L-glukos, 1% penicillin / streptavidin (DMEM +) till en sammanflytning av 75% i en 150 mm cellodlingsplatta. Utför i en huva steg från 10,1 till 10,7.
- Före transfektion, byta medium till medium som tidigare men utan fetalt kalvserum.
- För varje tung, lätt kedja transfektion, förbereda en transfektionsblandning med 2,5 ml av DMEM (utan serum), 9 pg av vektorn med den tunga kedjan, 6 pg av vektorn med den lätta kedjan, och 100 | il av polyetylenimin (PEI ) lösning (från en 1 | ig / | il lager). Inkubera vid rumstemperatur under 15 minuter.
- Försiktigt till 2,5 ml av transfektion blandning som framställts i steg 10.3 till HEK-celler i plattan. Rock plattan att fördela homogent.
- Icubate cellerna i inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 under 24 timmar.
- Ändra odlingsmediet till medium utan fetalt kalvserum.
- Samla mediet från plattorna fyra dagar senare.
Obs: Antikropparna i media kan användas för att karakterisera deras reaktivitet in vitro och in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sorteringen grind efter färgning CD22 och IgG-positiva celler visas i figur 1 i den här bilden området för dubbla positiva celler -. B-celler som producerar IgG-antikroppar - väljs för att sortera alla dessa celler i ett separat rör. I analysen, ca 1% av de totala PBMC motsvara detta dubbla positiva populationen. Antalet sorterade celler som erhålls kommer att bero på det antal celler, som erhållits i avsnitt 1.
De olika utfall efter 5 veckors EBV odödliggörande och CpG (ODN2006) stimuli visas i figur 2 Upptäckten av de växande kloner är lätt. WI38 matarceller har en mer långsträckt fibroblast-form, och B-cellkloner visas som mycket små runda celler som växer klustrade i mitten av den rundbottnad platta med flera brunnar. I detta skede är det uppenbart att vissa kloner börja växa. Emellertid kan den växande hastigheten vara variabel och naturligtvis några av brunnarna Containing förevigade celler kan inte ha några celler som växer alls.
Supernatanten från de växande klonema testas i en ELISA för att detektera IgG såsom visas i tabell 2. I denna ELISA en standardkurva för IgG testas, tillsammans med supernatanten av klonerna och tomrummen. En positiv klon betraktas när värdet vid ELISA är tre standardavvikelser över blankvärdet. Negativa kloner värderingar är under 3 standardavvikelser av ämnet. För bekräftelse bör positiva kloner vara positiva i ELISA minst tre gånger i olika supernatanter av samma klon och om möjligt verifierad av ett ytterligare screeningmetod.
Den fullständiga sekvensen för en human IgG-antikropp erhållen tillämpa de steg som beskrivs i detta manuskript visas i fig 3. Denna sekvens erhållits efter kloning av immunoglobulin tunga och lambdakedja paret från en klonalt expanderad B-cell. Variabel and konstanta regionerna i den tunga och lätta kedjan kan karakteriseras med denna teknik. Efter att ha erhållit sekvenserna, kan antikroppar sekvenser klonas och produceras in vitro i HEK-cellkulturer.
Figur 1. Flödescytometrisk analys av CD22 + och IgG + celler från humana perifera mononukleära blodceller. (A) Val av befolkningen i levande celler visas i P1. (B) framåt punktdiagram. (C) Storlek punktdiagram. (D) Y-axeln visar celler separerade genom anti-CD22-PerCP och på X-axeln separerades genom IgG-PE. P4 kvadrat indikerar cellfraktionen som har sorterats (CD22 + IgG +) och återvinnas för kultur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2. Representant bild av B-cell förevigade kloner i en 96 väl plattan efter fem veckors odling. (A) I denna väl ingen immortalisering observerades efter fem veckor, men WI38 bestrålade matarceller kan observeras. (B) En långsamt växande klon observerades i detta väl, med små runda aggregat i mitten. (C) Snabbväxande klon visar runt aggregat av odödliggjorda B-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. human antikropp sekvenser av tung och lätt kedja par från en human immortaliserad B-cellklon, F5.2, Indikerar V CDR1, CDR2 och CDR3-sekvenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1 st PCR-primers | ||
| Framåt (5'-3 ') | Reverse (3'-5 ') | |
| IgG | 5 'L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG | 3 'Cy CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC |
| 5 'L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG | ||
| 5 'L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG | ||
| 5 'L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG | ||
| κ | 5 'L Vk 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG | 3 'CK 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA |
| 5 'L Vk 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG | 3 'CK 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT | |
| 5 'L Vk 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG | ||
| 5 'Pan Vk ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG | ||
| λ | 5 'L Vλ en GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG | 3 'CX CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG |
| 5 'L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG | ||
| 5 'L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG | ||
| 5 'L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG | ||
| 5 'L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG | ||
| 5 'L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG | ||
| 5'L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG | ||
| 2 nd PCR-primrar | ||
| Framåt (5'-3 ') | Reverse (3'-5 ') | |
| IgH | 5 'EcoRI-VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG | 3 'Nhel JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT GACCAG |
| 5 'EcoRI-VH1 till 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG | 3 'Nhel JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG | |
| 5 'EcoRI-VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG | 3 'Nhel JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG | |
| 5 'EcoRI-VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG | ||
| 5 'EcoRI-VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'EcoRI-VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG | ||
| 5 'EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT GGTGCAG | ||
| 5 'EcoRI-VH en 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG | ||
| 5 'EcoRI-VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 'EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG | ||
| 5 'EcoRI-VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT GCAGGAG | ||
| 5 'EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT GCAGCAG | ||
| κ | 5 'EcoRI-Vk 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC | 3 'BsiWI Jk 1 till 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC |
| 5 'EcoR1 Vk 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC CCAGTCT | 3 'BsiWI Jk 2 GCCACCGTACG TTTGATCTCCAG CTTGGTC | |
| 5 'EcoR1 Vk 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC | 3 'BsiWI Jk 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC | |
| 5 'EcoR1 Vk 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC | ||
| 5 'EcoR1 Vk 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vk 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA CTCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vk 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vk 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vk 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT | ||
| 5 'EcoR1 VK 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC | ||
| 5 'EcoR1 Vλ en CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT GACKCAG | 3 'Avrll Jλ 1 till 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC TGACTCAG | 3 'Avrll Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG | 3 'Avrll Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 4-5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG CTGACTCA | 3 'Avrll Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC | |
| 5 'EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG | 3 'Avrll Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT | |
| 5 'EcoR1 Vλ 7 till 8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG GTGACYCAG | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| EN | 0,076 | 0,077 | 2,003 | 0,080 | 0,138 | 0,102 | 0,188 | 0,338 | 0,040 | 2.041 | 0,051 | 0,081 |
| B | 2,011 | 0,085 | 0,074 | 0,069 | 0,081 | 0,122 | 0,372 | 2,133 | 0,119 | 0,097 | 0,072 | 0,072 |
| C | 0,068 | 0,179 | 0,091 | 0,073 | 0,077 | 0,097 | 0,606 | 1,882 | 0,081 | 2,071 | 0,094 | 0,075 |
| D | 0,063 | 0,070 | 0,065 | 0,071 | 0,082 | 2,071 | 0,339 | 2,089 | 0,076 | 0,086 | 0,066 | 0,069 |
| E | 1,921 | 0,077 | 0,065 | 0,085 | 0,095 | 1,968 | 1,910 | 0,122 | 0,072 | 0,070 | 0,065 | 0,066 |
| F | 0,113 | 0,068 | 0,066 | 0,082 | 0,088 | 0,090 | 0,460 | 0,070 | 0,079 | 0,952 | 0,098 | 0,065 |
| G | 2.041 | 2,108 | 1,472 | 0,665 | 0,331 | 0,194 | 0,123 | 0,094 | EFT "> 0,0800,072 | 0,070 | 0,072 | |
| H | 2,146 | 2,132 | 1,634 | 0,665 | 0,341 | 0,178 | 0,132 | 0,094 | 0,082 | 0,080 | 0,074 | 0,068 |
| Standarder ng / l | 1000 | 500 | 250 | 125 | 62,5 | 31,25 | 15,6 | 7,8 | 3,9 | 1,95 | 0,975 | 0 |
Tabell 2. Representativa resultat av IgG screening genom ELISA. Klona supernatanterna i A1-A10, B1-B10, C1-C10, D1-D10, E1-E10, F1-F10. Ämnena i A11, B11, C11, D11, E11, F11, A12, B12, C12, D12, E12, F12.Standard kurva dupliceras: G1-G12 och H1-H12. Motsvarande koncentration av immunoglobuliner i varje duplikat visas below.Positive eller IgG-producerande kloner visas i mörkgrått. Negativa eller icke-IgG-producerande kloner visas i ljusgrått
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta manuskript, är alla steg för generering av IgG-antikroppar från humana PBMC som presenteras i detalj. Detta protokoll innehåller några fördelar jämfört med tidigare publicerade tekniker. En av fördelarna är att den antikropp som produceras håller de tunga och lätta kedjorna som motsvarar ursprungsparet i den B-cellklon. Identifieringen av IgG-antikroppar kan göras på alla typer av mänsklig givare, och det finns inget behov av försämring av immunsvaret på grund av vaccination 5. Användningen av fibroblastcellinjen WI38 som ett matarcell, tillåter en snabbare upptäckt av de växande kloner, eftersom de är morfologiskt annorlunda och mycket lätt att differentiera, jämfört med de PBMC som används som matarcell i tidigare beskrivna arbetena 1,6- 8. Dessutom användning av WI38 som en matarcell gynnar frysningen av stora mängder av cell portioner som lätt kan tinats och odlade före varje experiment.
En av kritiCal steg i detta protokoll är utgångsmaterialet: i PBMC. Om blod har väntat alltför länge för centrifugering, eller efter extraktion av PBMCs, de lagras inte i lämpliga frost; som sådan antalet viabla celler kommer att minskas, tillsammans med antalet av B-cell-IgG producerande kloner erhållna. Av detta skäl, en tidig extraktion och en god konservering av PBMC rekommenderas för ett framgångsrikt resultat. Antalet IgG-producerande kloner kommer att begränsas till det antal av PBMC vid början av experimentet. Högre antal PBMC kommer att ge högre antal IgG-producerande kloner och ett mångsidigt antikroppsproduktion. Ett annat kritiskt steg är kloningen av PCR-fragmenten av de lätta och tunga kedjorna i antikroppen. Om ligeringen inte lyckas efter flera försök, är ett extra steg för kloning av 2: a PCR-produkten i en TopoTA systemet rekommenderas. Digere av insatsen med de lämpliga enzymerna kan vara lättarei TopoTA vektorn, för en efterföljande ligering i pFUSEss expressionsvektorer.
Denna teknik kan överföras till vilken som helst typ av human vävnad i vilken humana B-celler anrikas 3. Den kan också användas för att studera andra typer av immunoglobuliner, bara genom att ändra de märkta antikropparna som används för att sortera (antikroppar mot IgM, IgE, IgA eller IgD), varvid primer design för PCR, och de uttryckande vektorer. Studierna av dessa immunoglobuliner kan vara av intresse för att förstå, initialt immunsvar, slemhinna antikroppsutsöndring och allergiprofiler, bland andra.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit en teknik för att producera humana rekombinanta monoklonala IgG-antikroppar som lämnar de tunga och lätta kedjor par av det humana immunoglobulinet intakt. Tekniken är användbar och lätt att utföra utgående från ett blodprov. De monoklonala antikroppar som erhållits genom denna metod är potentiellt användbara vid studier av humant immunsvar. Dessutom kan monoklonala antikroppar producerade med denna metod vara en bra utgångspunkt för utvecklingen av immunterapi för olika sjukdomstillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Forskning kontrakt Miguel Servet (ISCIII CD14 / 00032) till (GN-G.). Fellowship från Nederländerna Organisationen för vetenskaplig forskning "Graduate School of Translational Neuroscience Program" (022005019) till (CH).
Bidrag från Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) och Association française contre les Myopatier till (PM-M.); samt genom en Veni Fellowship of Nederländerna Organisationen för vetenskaplig forskning (916.10.148) en gemenskap av Hjärnfonden Nederländerna (FS2008 (1) -28) och Prinses Beatrix Fonds (Project WAR08-12) (till ML ).
Vi tackar Jozien Jaspers för hennes hjälp i B-cellsortering genom flödescytometri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | solution containing polysucrose and sodium diatrizoate |
| FACSAria II cell sorter | BD Biosciences | ||
| 96 U-bottom micro well plates | Costar | 3799 | |
| Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco, Life Technologies | 12633-020 | |
| 30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line | ATCC | CRL-1612 | 3.4 x 108 copies/ml |
| CpG2006 | Invivogen | ODN 7909 | |
| Wi38 cells | Sigma-Aldrich | 90020107 | |
| Interleukin-2 | Roche | 10799068001 | |
| ELISA plates | Greiner Bio-One, Microlon | 655092 | |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific (unconjugated) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-008 | |
| 4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker) | Biorad | 170-6404 | |
| Human IgG | Sigma | I 2511 | HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml |
| Goat F(ab)2 antihuman IgG Fcγ (conjugated with peroxidase (PO)) | Jackson ImmunoResearch | 109-036-008 | |
| ELISA reader (Perkin Elmer 2030) | Perkin Elmer | 2030-0050 | |
| Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5µ | Jackson ImmunoResearch | 309-035-095 | |
| SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System | Invitrogen | 18080-200 | |
| Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700 | Applied Biosystems | ||
| High Pure RNA Isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| Reverse transcription system kit | Promega | A3500 | |
| Recombinant Taq DNA Polymerase | TAKARA | R001A | |
| Primers (2 μl) | Sigma | ||
| Ultrapure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 100 bp ladder | Invitrogen | 15628-019 | |
| Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000) | Biorad | 170-8100 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28106 | |
| BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit | Applied Biosystems | 4337455 | |
| 0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Genetic analyser ABI300 | Applied Biosystems | 4346906 | |
| DH5α competent cells (E. coli) | Invitrogen | 18263-012 | |
| pFUSEss-CHIg-hG1 (4,493 bp) | Invivogen | pfusess-hchg1 | |
| pFUSEss-CHIg-hG4 (4,484 bp) | Invivogen | pfusess-hchg4 | |
| pFUSE2ss-CLIg-hk (3,875 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hclk | |
| pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3,883 bp) | Invivogen | pfuse2ss-hcll2 | |
| SOC medium | Invitrogen | 15544-034 | |
| LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar) | Invivogen | fas-zn-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB) | Invivogen | fas-zn-l | |
| DNA Miniprep kit | Omega Bio Technology | D6942-02 | |
| Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer) | Nanodrop | ||
| LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar) | Invivogen | fas-bl-s | |
| Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB) | Invivogen | fas-bl-l | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | 20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1 |
| 2-Log DNA ladder | New England Biolabs | N3200S | 0.1-10.0 kb, 1,000 μg/ml |
| XmaI | New England Biolabs | R0180S | 10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| BsiWI | New England Biolabs | R0553S | 10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1 |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | 5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | 1 U/µl, in 10x FastAP Buffer |
| DH5α competent cells | Invitrogen | 18263-012 | |
| PE Mouse Anti-Human IgG | BD Pharmingen | 555787 | |
| anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22 | Fisher scientific | BDB563942 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| BigDye Terminator v3.1 | Applied Biosystems | 4337455 |
References
- Vrolix, K., et al. Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor. J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).
- Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. Recent advances in the generation of human monoclonal antibody. Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).
- Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies. Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).
- Losen, M., et al. Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation. Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Fraussen, J., et al. A novel method for making human monoclonal antibodies. J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).
- Traggiai, E., et al. An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus. Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).
- Fraussen, J., et al. Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).
- Yamashita, M., et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization. Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).
- Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. Human B cell immortalization for monoclonal antibody production. Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).
- Traggiai, E. Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies. Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).
- Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by. John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
- Ibrahim, S. F., van den Engh, G. Flow cytometry and cell sorting. Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).
- Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells. Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).
- Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines. J Vis Exp. (57), 3321 (2011).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
