Silence de<em> BRCA2</em> D'identifier les fonctions biologiques de BRCA2 réglementés nouveaux dans les cellules humaines en culture
Summary
Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.
Abstract
Silence de la protéine suppresseur de tumeur BRCA2 et sa détection par des analyses biochimiques classiques représentent un grand défi technique en raison de la grande taille de la protéine BRCA2 humain (environ 390 kDa). Nous rapportons modifications des protocoles standard de transfection et de réduire au silence immunoblotting siARN BRCA2 humain endogène et détecter la protéine BRCA2, respectivement, dans des lignées cellulaires epitheliales humaines. Les étapes clés comprennent une forte siRNA transfection ratio de réactif et de deux rondes subséquentes de transfection de siRNA dans la même expérience. L'utilisation de ces et d'autres modifications au protocole standard, nous réalisons systématiquement plus de 70% le silençage du gène BRCA2 humain tel que jugé par une analyse immunoblot avec des anticorps anti-BRCA2. En outre, la dénaturation des lysats de cellules à 55 ° C au lieu de la classique de 70 à 100 ° C et d'autres techniques d'optimisation de la procédure d'immuno-empreinte permet la détection de la protéine BRCA2 intact même when très faibles quantités de matière de départ sont disponibles ou lorsque les niveaux d'expression de protéine BRCA2 sont très faibles. Silençage efficace de BRCA2 dans les cellules humaines propose une stratégie utile pour perturber la fonction de BRCA2 dans les cellules avec BRCA2 intacte, y compris les cellules tumorales, à examiner de nouvelles voies moléculaires et les fonctions cellulaires qui peuvent être affectés par des mutations de BRCA2 pathogènes dans les tumeurs. Adaptation de ce protocole pour le silençage et l'analyse d'autres protéines «grands» comme BRCA2 efficace devrait être facilement réalisable.
Introduction
Le gène BRCA2 (BReast susceptibilité au cancer gène-2) code pour une protéine suppresseur de tumeur qui joue un rôle crucial dans la réparation des cassures double-brin par régulation de la fonction de l'enzyme recombinase Rad51 1. BRCA2 a également été impliquée dans la modulation de la transcription dans la cellule et le contrôle du cycle 2. Les mutations germinales dans le gène BRCA2 induisent un mode autosomique dominant la susceptibilité au cancer du sein et le cancer de l'ovaire chez les femmes et le cancer de la prostate chez les hommes, ainsi que la prédisposition à d'autres types de cancer 3,4. Cependant, en dépit de l'augmentation du risque dans le développement de cancers, des mutations de BRCA2 qui suppriment ou réduisent fonction de BRCA2 peut rendre les cellules cancéreuses plus vulnérables aux agents chimiothérapeutiques qui causent des dommages de l'ADN 5-7. Cancers sporadiques présentent un taux de mutations BRCA2 (<3%) bien que des niveaux réduits de protéine BRCA2 ont été détectés dans certains types de cancers faible, ce qui suggère que la protéine BRCA2peut être perdue lors de la tumorigenèse dans les cancers sporadiques à travers des mécanismes non-mutation-dépendantes 7,8. Ainsi, il est important de bien comprendre les fonctions de BRCA2 dans le cadre de la biologie du cancer ainsi que dans d'autres milieux biologiques.
Un outil puissant utilisé pour identifier de nouvelles fonctions d'un gène dans des cellules de mammifères est de réduire au silence l'expression. A titre d'exemple, réduire au silence l'expression de BRCA2 dans une variété de cellules epitheliales normales a récemment conduit à l'identification d'une nouvelle fonction de BRCA2 en tant que régulateur de la résistance de anoikis, une étape importante lors de l'acquisition de cellule cancéreuse capacité invasive et métastatique 9. Gene silencing peut être réalisé en introduisant dans les cellules soit faible interférence (si) ARN court en épingle à cheveux ou (sh) des molécules d'ARN ciblant le gène spécifique. La puissance élevée de siRNA et sa facilité d'utilisation en font un outil privilégié pour faire taire des expériences visant à acquérir de nouvelles connaissances sur les processus biologiques critiques, une pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant, knockdown efficace de l'expression génique peut ne pas être facilement réalisable pour tous les gènes et peut être très variable en fonction du type de cellule. Parce qu'une diminution des niveaux de protéines intracellulaires est le phénotype le plus pertinent à l'étude, il est crucial de quantifier l'inactivation génique analyse par immunotransfert du produit de gène. Avec cet égard, la protéine BRCA2 présente une autre difficulté: être d'une grande protéine (environ 390 kDa), des difficultés techniques existent pour l'analyse biochimique classique, y compris immunotransfert.
Nous rapportons ici un protocole optimisé pour une inactivation efficace de BRCA2 dans des lignées cellulaires epitheliales humaines et pour la détection rapide et efficace de la protéine BRCA2 knockdown analyse par immunotransfert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Parce que les mutations de la lignée germinale de la sonde du gène BRCA2 à un risque accru de plusieurs types de cancer, notamment le cancer femelle et mâle du sein, du cancer de l'ovaire, le cancer de la prostate, le cancer du pancréas et le mélanome 3,4, un certain nombre d'études ont été entreprises pour comprendre la fonction biologique de la protéine BRCA2. La plupart de ces études sont d'origine génétique basée principalement en raison de difficultés techniques dans l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project “FaReBio di Qualità”.
Materials
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Non-targeting Pool |
| Lipofectamine RNAiMAX Reagent | Life Technologies | 13778075 | Transfection Reagent |
| OPTI-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Medium for transfection procedure |
| NuPAGE Tris-Acetate 3-8% 1,5 mm Gel precast | Life Technologies | EA0378 | Gel for protein electrophoresis |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Life Technologies | NP0007 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Sample Reducing agent (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagent for protein electrophoresis |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagent for protein electrophoresis |
| HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Prestained marker for gel electrophoresis |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipment for protein electrophoresis/transfer |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagent for Western blotting |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Reagent for Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagent for Western blotting |
| BRCA2 H-300 rabbit polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | 1:300 dilution |
| Beta-tubulin monoclonal antibody | Sigma Aldrich | T4026-100UL | 1:1000 dilution |
| Skim Milk powder | Sigma Aldrich | 70166 | Reagent for Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagent for Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Chemiluminescent Substrate | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Chemiluminescence system |
| PNT1A cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 95012614 | PNT1A human, normal prostate epithelium immortalized with SV40 |
| Nthy cells | SIGMA Aldrich (for ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Cell Line human, thyroid follicular epithelial cells |
| Cell Proliferation Kit I (MTT) | Roche | 11465007001 | Kit for cell proliferation assays |
Riferimenti
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