Summary
Ved hjælp af høj opløsning kontrast differential interferens (DIC) mikroskopi er en ex vivo observation af det bankende af motile ependymale cilier beliggende inden for de mus hjerneventriklerne demonstreret ved levende billeddannelse. Teknikken tillader en optagelse af den unikke ciliær slagfrekvens og slå vinkel samt deres intracellulære calcium svingning pacing egenskaber.
Abstract
Multiciliated ependymceller linje hjertekamrene i den voksne hjerne. Unormal funktion eller struktur ependymale cilier er forbundet med forskellige neurologiske underskud. Den nuværende ex vivo levende billeddannelse af motile ependymale cilier teknik giver mulighed for en detaljeret undersøgelse af ciliære dynamik efter flere trin. Disse skridt omfatter: mus eutanasi med kuldioxid i henhold til protokoller fra University of Toledos Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC); kraniektomi efterfulgt af hjernen fjernelse og sagittale hjerne dissektion med et vibratome eller skarp kniv til at opnå meget tynde sektioner gennem hjernen laterale ventrikler, hvor ependymale cilia kan visualiseres. Inkubation af hjernens skiver i en tilpasset glasbund plade indeholdende Dulbeccos modificerede Eagles Medium (DMEM) / High-glucose ved 37 ° C i nærvær af 95% / 5% O2 / CO2-blanding er vigtigt at holde vævet i live undereksperimentet. En video af cilier slå derefter optaget med en høj opløsning kontrast differential interferens mikroskop. Videoen analyseres derefter ramme for ramme til at beregne den ciliære bankende frekvens. Dette giver mulighed for præcis klassifikation af de ependymceller i tre kategorier eller typer baseret på deres ciliære bankende frekvens og vinkel. Desuden er denne teknik muliggør anvendelse af højhastigheds-fluorescensimagografi analyse for at karakterisere de unikke intracellulære calcium svingning egenskaber ependymceller samt virkningen af farmakologiske midler på calcium svingninger og den ciliære bankende frekvens. Desuden er denne teknik er velegnet til immunfluorescens billeddannelse til ciliær struktur og ciliære proteinlokalisering undersøgelser. Dette er særlig vigtigt i sygdomsdiagnose og fænotype undersøgelser. Den væsentligste begrænsning af teknikken tilskrives faldet i levende motile cilia bevægelse som hjernevævet begynder at dø.
Introduction
Cilier er sensoriske mikrotubulus-baserede organeller, der strækker sig fra celleoverfladen til det ekstracellulære miljø. Afhængigt af deres mikrotubuli organisation, kan cilier kategoriseres i to typer - "9 + 0" eller "9 + 2". Funktionelt, baseret på deres motilitet, kan disse klassificeres som motile eller ikke-motile cilier 1. Primære cilier er et udtryk, der almindeligvis anvendes til at betegne "9 + 0" ikke-motile cilier. Disse har ni parallelle dublet mikrotubuli (betegnet med '9') og en central par mikrotubuli er fraværende i den centrale kappe (betegnet med '0'). Men nogle "9 + 0" cilier, såsom nodal cilier, som regulerer embryo laterality er bevægelige 2. På den anden side er motile cilier karakteriseret, foruden de ni parallelle mikrotubuli dubletter, ved et yderligere centralt par mikrotubuli dubletter og associeret med dynein motordrevne proteiner for at lette motilitet. Desuden er nogle "9+2 "Cilier, såsom olfaktoriske cilier er ikke-motile 3. Ependymceller beklæder hjernens ventrikler og den centrale kanal af rygmarven er kendetegnet ved motile cilier der fremdrive cerebrospinalvæsken (CSF) langs hjerneventriklerne 4.
Det overordnede mål med denne metode er at gøre det lettere at studere den bevægelige cilia dynamik og strukturelle abnormiteter. Hjernens sundhed og udvikling er stærkt afhængige af en effektiv cirkulation af CSF inden hjerneventriklerne. For eksempel, normal cerebrospinalvæskestrømmen og væskebalance kræver normal slå og funktionel ependymale cilia 5,6, hvilket igen spille kritiske roller i regulering af retningsbestemt bevægelse af neuronale celler og stamceller migration 7. Som sådan unormal ependymale cilier funktion eller struktur kan føre til unormal cerebrospinalvæskestrømmen, som er forbundet med hydrocephalus, en medicinsk tilstand, hvor der er en unormal akkumulering af CSF i ventriklerne af Bregn. Dette kan derfor medføre øget intrakranielt tryk og progressiv udvidelse af hovedet, kramper, tunnel vision, og psykisk handicap 8.
Fordelene ved denne teknik i forhold til eksisterende metoder er, at det er tilladt for første gang til at rapportere tre forskellige ependymale celletyper: I, II, og III, baseret på deres unikke ciliær slagfrekvens og slå vinkel. Disse ependymceller er lokaliseret inden for visse områder i hjernen hjertekamrene. Endvidere kan virkningerne af alder og farmakologiske midler, såsom alkohol og cilostazol på ændring af ependymale celletyper eller deres lokaliseringer påvises, hvilket ikke var muligt før denne klassificering af ependymceller. Cilostazol er en inhibitor af phosphodiesterase-3, et enzym, der nedbryder cAMP til AMP og det regulerer også intracellulært calcium 9. Ved hjælp af high-speed fluorescensimagografi analyse giver billedbehandling og kvantitativ bestemmelse af den unikke intracellulærecalcium svingning egenskaber af de ependymceller. For eksempel, både alkohol og cilostazol signifikant ændret den ependymale ciliære slagfrekvens samt de intracellulære calcium svingninger egenskaber, som igen kan føre til en ændring i den væskeerstatning cerebrospinal volumen ved ependymale cilier 10. Sammenfattende denne teknik var nøglen til at give de første beviser for tre forskellige typer af ependymceller med forskellige calcium svingning egenskaber.
I det følgende afsnit, er et detaljeret trin-for-trin oversigt over proceduren, meget opmærksom på væv forberedelse og håndtering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedurerne for anvendelse dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af The University of Toledo i overensstemmelse med retningslinjerne i Institutional Animal Care og brug Udvalg på National Institutes of Health og Guide for pleje og brug af forsøgsdyr.
1. Brain Udvinding, Sektionsinddeling og Tissue Forberedelse
- Sacrifice vildtype musestamme C57BL / 6 ved dybt euthanizing med CO 2 kvælning i 5 min. Forsikre døden ved cervikal dislokation.
- Rengøre musen hoved med 70% ethanol.
- Udføre kraniektomi med sterile sakse og tænger ved først at trække skindet, begyndende med toppen af hovedet for at blotlægge kraniet.
- Derefter, når kraniet er blotlagt, fjerne kraniet ved skrælning knoglen stykke-stykke, startende fra den bageste side og bevæger sig mod den forreste side. Vær forsigtig ikke at ødelægge hjerneventriklerne.
- Saml hele hjernen.
- Placer hjernen i en 100 mm petriskål indeholdende DMEM / High-glucose suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin-opløsning indeholdende 10.000 enheder / ml penicillin og 10.000 ug / ml streptomycin og foropvarmet til 37 ° C.
- Skær hjernen på medianen sagittale plan i hånden med en skarp kniv, og få den første 100-200 mm sektion fra hver halvdel ved hjælp af en vibratom.
- Skyl hjernevæv med forvarmet 37 ° C phosphatbufret saltvand (1x PBS).
- Anbring straks hjernen afsnittet i DMEM / høj-glucose medier præ-opvarmet til 37 ° C.
2. Levende Imaging Konfiguration og opsætning
- Placer hjernen vævssnit i 30 mm glas-bottom dyrkningsskåle indeholdende 1 ml DMEM / høj glucose medier. Juster mikroskopets lukket rum miljø til 37 ° C, 95% / 5% O2 / CO2-indhold (figur 1
- Ved hjælp af en 60X objektiv olieimmersion linse, indsamle de ependymceller / cilia billeder ved først at placere en olie dråbe på 60X objektiv og fokusere på cellerne med regelmæssige DIC transmitterede lys.
- Følg derefter retningen af DMEM boble bevægelse som en vejledning til placeringen af den bevægelige ependymale cilier som ciliære prygl skabe en slags boble bevægelse i området. Vælge et område med sunde celler med motile cilier i hjernens laterale ventrikel under anvendelse af DIC filter. Når ependymale cilia findes, justere lys og fokusere på at opnå et tilfredsstillende billede.
- Indstil de levende imaging driftsparametre efter et bestemt formål ved hjælp Metamorph imaging software. I nærværende demonstration erhverve fireogtyve-bit billeder med kameraet binning indstillet til 1 x 1 kombineret med 60X objektiv og 5-10 ms eksponeringstid.
- Indsamle DIC billederne ved at åbne mikroskop blænden til et optimalt niveau for at have et minimum exposure tid. Overhold levende billeder strøm til kameraet for at give hurtig og øjeblikkelig billedoptagelse uden forsinkelse. Beregn hastigheden af cilier bankende baseret på kravet om de minimale eksponeringstider for at opnå tilstrækkelig kontrasten.
3. Data, visualisering og analyse
- Beregne antallet af cilia prygl ved at tælle antallet af slag i 1 min. Gøre dette ved at nedsætte hastigheden af video og tælle antallet af slag under anvendelse af en celle tæller eller lignende værktøj.
- For at beregne hyppigheden af prygl, formere eksponeringen tidspunkt, hvor videoen er optaget med antallet af de rammer eller time-lapse billeder erhvervet at få antallet af sek. (Eksempel: eksponeringstid 5 ms 200 frames = 1,000 msek eller 1 sek).
- Beregne antallet af slag i ét sekund for at opnå den frekvens, som er udtrykt som antallet af slå per én sek. Gør dette ved at dividere antallet af cilia prygl over en én-anden gang interval (Eksempel: cilier slår 50 gange i 200 frames video optaget på eksponeringstid på 5 ms, dvs. 5 ms x 200 frames = 1 sek, nu dividere 50 slag med 1 sek = 50 Hz).
- Beregn ciliære bankende vinkel ved at vurdere den vej, som den ependymale cilier i både strøm- og nyttiggørelse slagtilfælde. Udfør denne ifølge en tidligere beskrevet metode, med mindre modifikationer 11. Observeres Den præcise bevægelse af individuelle cilier under hele taktslag cyklus.
- På en acetat ark placeret over skærmen, tegne en vandret linie langs ependymale kant og en lodret linje gennem midterlinjen position af cilier i begyndelsen af arbejdsslaget.
- Plot den præcise position af cilium billede for billede, da den bevæger sig fremad under power slagtilfælde. På en tilsvarende måde, plotte bevægelsen af cilia i restitutionsperioden slagtilfælde.
- Beregn ciliaere bankende vinkel fra den maksimale afvigelse af cilium fra midterlinjen under tHan magt slagtilfælde samt opsvinget slagtilfælde.
4. Calcium Signal Recording
- Efter udskæring hjernen kortvarigt skyl hjernen skive med 1x PBS eller Dulbeccos PBS (pH 7,0). Forberede frisk Fluo-2 for at undgå fluorescens-quenching og for at opnå godt signal-støj-forhold.
- Forberede 1 mM stamopløsning af Fluo-2-opløsning i dimethylsulfoxid (DMSO), blandes og vortex opløsning i mindst 5 minutter for at sikre, at Fluo-2 homogent opløses i DMSO.
- Den Fluo-2 stamopløsning i 500 ml DMEM / High-glucose suppleret med 2% B27 Fortynd forvarmet til 37 ° C til en slutkoncentration på 20 mg / ml.
BEMÆRK: B-27 er en optimeret serumfrit supplement indeholdende vitamin A, antioxidant cocktail og insulin anvendes til at støtte kort- eller langsigtede levedygtighed hippocampus og andre CNS-neuroner. - Inkuberes straks hjernen skive med 20 mg / ml Fluo-2 i 30 minutter ved 37 ° C i et glas-bundplade.
- At bestemme den optimale læsning koncentration af calcium fluorophor Fluo-2 og calcium farvestof celletoksicitet, tackling celler med ATP undgå, og kontroller cellelevedygtigheden ved at bestemme tidsforløbet og spidsværdien af calcium signaler som respons på ATP.
- Optage videoer til calcium svingning ved en opsamling på 5 msek i mindst 1 sek (200 billeder pr sekund), med excitations- og emissions- bølgelængder på 488 nm og 515 nm (Film 2).
- At skelne Fluo-2 calcium signal fra autofluorescens eller bevægelse artefakter, sikre, at de intensiteter, der udsendes ved 515 nm overvåges separat.
BEMÆRK: Fluo-2 er ikke calcium fluoremetric egnet til at kvantificere intracellulært calcium. Det er imidlertid en fremragende dynamisk calcium farvestof til at detektere hurtige calciumændringer, såsom calcium- svingninger. For mere nøjagtig calcium kvantificering er Fura-2 anbefales. Imidlertid er de dynamiske ændringer af Fura-2 begrænset af dens ratiometriskarten af farvestoffet. - Følg formler fra producenten til at beregne den nøjagtige gratis intracellulære calcium værdier. Eksempel [Ca2 +] = Kd × (R - R min) / (R max - R). Hvor Kd er dissociationskonstanten af farvestoffet fra den frigjorte calcium, R er den målte fluorescens ved 488, og R min og Rmax er fluorescens-forhold ved minimal og maksimal ionkoncentration 12.
5. immunfluorescensmikroskopi
- Fix hjernen sektioner med phosphatpufret saltopløsning indeholdende 4% paraformaldehyd (PFA) og 2% saccharose i 10 min. Alternativt, løse hele hjernen med 4% PFA og derefter afsnittet i 50 mm sektioner ved hjælp af en kryostat.
- Vask vævet tre gange med 1x PBS i 5 minutter hver gang.
- Inkubér hjernen skive med en solutipå 0,1% Triton-X i 1x PBS i 5 minutter, derefter skylles tre gange med 1 x PBS i 5 minutter hver gang.
- Inkubér hjernen skive med muse primært antistof, antiacetylated a-tubulin, anvendt i en fortynding på 1: 5.000 i 10% FBS i 1x PBS i en time ved stuetemperatur (RT) eller natten over ved 4 ° C.
- Vask vævet tre gange med 1x PBS i 5 minutter hver gang.
- Inkubér hjernen skive i sekundært antistof, fluorescein anti-mus IgG ved en fortynding på 1: 500 i 10% FBS i 1 x PBS-opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
- Før observation under et fluorescensmikroskop, kontrastfarve afsnittet med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i 5 min for at farve kernen (eller DNA) 13. For at minimere fotoblegning image sektionerne straks med minimum eksponeringstid muligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Måling ependymale cilier funktion i levende musehjerne
Den i dette protokol fremgangsmåde anvendes til at overvåge ependymale cilia funktion og struktur i frisk væv dissekeret fra muse hjerne samt at overvåge og studere cilier bankende frekvens. De trin følges for at opnå en fuldstændig eksperiment er afbildet på skematisk rutediagram (figur 1). Det anbefales stærkt, at forsøget udføres inden for en kort tidsramme for at holde den bevægelige cilier så aktiv som muligt. Et repræsentativt time-lapse film og billeder af ependymceller og deres bevægelige cilier er også vist (Movie 1 og figur 2a). Dataanalyse i den opnåede strøm opnås ved at tælle slag og vinkel mønster af bevægelige cilier. Kriterierne for at dividere cilier i tre typer er vist i tabel 1. Tilstedeværelsen af ependymale cilier er konfiRMED med en ciliær markering, acetyleret-a-tubulin, og ependymceller er modfarvet med DAPI (DNA-markør) for at vise kernen (figur 2b). Baseret på vores observationer af ependymceller i hjernen laterale ventrikel fra mindst 22 uafhængige forsøg, var vi i stand til at klassificere ependymceller i tre typer baseret på deres ciliære bankende frekvens. Desuden har vi demonstreret, at ethanol ved 0,25% koncentration signifikant undertrykt cilia slagfrekvens uanset deres type (figur 3). Endnu vigtigere er, er disse data i konsistens med vores tidligere fund 10.
Måling calcium signalering ved ependymale cilier
Det er tidligere blevet vist, at bøjning af cilier kan udløse en cilium-afhængig intracellulært calcium signalering 14-16. Denne teknik gør det muligt for forskere at undersøge og måle den intracellulære calcium-signal inden hjerneventriklerne
Figur 1:. Ependymale cilier imaging-protokol flowchart ependymale cilier imaging-protokol illustrerer trin for at fuldføre et eksperiment starter fra mus brainextraction, sektionering og forberedelse væv til indsamling og analyse image. En omtrentlig en time tidslinje præsenteres med trin-for-trin procedure.
e 2 "src =" / files / ftp_upload / 52853 / 52853fig2.jpg "/>
Figur 2:. Ependymale cilia lokalisering i hjerneventriklerne Her vises ependymceller fra den laterale ventrikel i en musehjerne. (A) DIC billeder af individuelle ependymceller (nederst pile) og cilier (top pile) er vist. (B) Et overlay billede af en hjerne sektion er farvet med antistof mod en ciliær markering, acetyleret a-tubulin, er vist i grønt (øverste pile), og modfarvet med en nuklear / DNA-markør, DAPI, er vist i blå (nederste pile) . Bemærk venligst, at panelerne a og b repræsenterer forskellige hjernesektioner.
Figur 3:. Alkohol og forskelle i cilier slå frekvenser blandt typer af ependymceller af muse hjerne laterale ventrikel Den ex vivo hjerne skive blev inkuberet uden (kontrol) eller med (Ethanol) 0,25% alkohol i 5 min. Sammenlignet med kontrol, alkohol behandling faldt betydeligt cilia bankende frekvens, som angivet med en asterisk. Mindst 5-10 uafhængige præparationer blev anvendt til hver ependymale celletype og behandlingsgruppe.
Film 1: Registrering af ependymale cilier i type III ependymceller Her vises optagelser af ependymale cilier, karakteriseret ved at slå frekvens og vinkel unikt at skrive III ependymceller fra hjernen tredje ventrikel.. Dette tal er tidligere blevet rapporteret 10 og blev genbrugt med tilladelse.
Film 2: Intracellulær calcium svingning i ependymceller Her vises optagelser af calcium svingninger af ependymceller gennem en sektion af hjernens laterale ven.tricle efter inkubation hjernen skive med 20 mg / ml calcium-indikator, Fluo-2, i 30 minutter ved 37 ° C. Hjernen sektionens calcium niveau blev studeret og pseudo-farvet. Farven bar angiver ependymceller 'calcium niveau; hvor sort-lilla og rød-gule repræsenterer lave og høje calcium niveauer, hhv. Til intracellulær calcium kvantificering, vil ependymale celle calcium beregnes ud fra flere individuelle ependymceller som nævnt i protokollen tekst og gennemsnit mellem kontrol- og behandlingsgruppen. Videoen af calcium oscillation blev optaget ved 200 billeder pr sekund med excitations- og emissions- bølgelængder på 488 nm og 515 nm. Dette tal er tidligere blevet rapporteret 10 og blev genbrugt med tilladelse.
| Ependymale celletype | Cilia slå frekvens | Cilia slå vinkel |
| Type I | > 60 Hz | <90 ° |
| Type II | 30-60 Hz | 90-135 ° |
| Type III | <30 Hz | > 135 ° |
Tabel 1:. Typer af ependymale cilier Klassifikationen af ependymale cilier i type I, blev II eller III primært baseret på det bankende frekvens og slå vinkel ependymale cilier placeret inden distinkte områder af hjernen tredje ventrikel. Dele af disse data er tidligere blevet rapporteret, og blev genbrugt her med tilladelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er en protokol til fremstilling af muse hjernevæv for både live-billeddannelse og fluorescensmikroskopi, der giver en hurtig og følsom tæt observation af ependymale cilier inden hjerneventriklerne. Denne teknik er ikke begrænset til kun de laterale ventrikel; Det kan bruges til at observere cilia i andre hjerneventrikler. Denne imaging teknik giver en live stream, der ligner bevægelsen af CSF ved ciliær bankende i en ex vivo indstilling. Desuden sætter analyse af retningsbestemt bevægelse af cilia. Dette er hovedsageligt lettes ved anvendelse af en fluorescens imaging system med høj opløsning DIC og. En fordel ved dette system er, at mikroskopet er indesluttet i et klimakammer, som giver mulighed for en fin regulering af temperatur, fugtighed og CO 2 niveauer. Disse er meget kritiske parametre, der bør overvejes for overlevelsen af celler og væv, når der udføres direkte billedvisning experiments. Systemet er også udstyret med automatiske XY og Z-moduler samt et digitalt kamera og bølgelængde filter switcher, som alle er vigtige funktioner til at lette billeddannelse af dynamiske cellulære adfærd, såsom cilia bevægelser. Mikroskopet er sluttet til en computer, og erhvervelse af billeder af høj kvalitet lettes ved billeddannelse software.
Brug af denne teknik til at klassificere ependymceller i adskilte typer tilbyder en signifikant fremskridt i forhold til eksisterende / tidligere fremgangsmåder anvendes til at studere ependymale cilia. For eksempel kunne virkningen af visse farmakologiske eller toksiske midler, såsom alkohol på anden måde minimeres eller ophæves, hvis ependymceller betragtes som én population 17. Det er vigtigt at huske på, at på trods af, at de særlige kendetegn ved fimrehår slå frekvenser og vinkler er meget forskellige blandt disse tre typer af ependymale cilier, har vi lige begyndt at forstå fysiologi disse celler. DerforIfølge vores tidligere arbejde, vores klassifikation er robust nok, hvis proceduren udføres korrekt som beskrevet i denne protokol.
Identifikation særskilt ependymale cilier er fundamentalt vigtigt at få en grundlæggende forståelse af ependymale fysiologi. Denne metode gør det muligt at skelne mellem tre forskellige typer af ependymceller entydigt og specifikt placeret inden for den tredje ventrikel i forhold til det bankende frekvens og vinkel, der fører til klassificering i tre forskellige typer (tabel 1). For at bekræfte, at forskellene i cilier slå frekvenser ikke skyldes forskelle i levedygtighed ependymceller eller forskelle i dyret alder, anbefales det, at kun intakte og undetached ependymale strimler eller skiver, der er fastgjort til neuronalt væv og mindst 100 mm tykke anvendes. Desuden bør måles ciliaere bankende frekvens på forskellige steder langs hver ependymale sektion. Vi har tidligere vist, at ciliær slagfrekvens data genereret ved anvendelse af denne teknik har været konsekvent reproducerbar blandt 87 eksperimentelle observationer 10. Derfor er ependymceller præcist klassificeret afhængigt af deres ciliære slå. Desuden, når anvendelse af farmakologiske midler, som vides at nedsætte ciliære bankende frekvens, cilia slagfrekvens bør teoretisk vende tilbage til normal bankende frekvens efter fjernelse af disse farmakologiske midler.
Et afgørende skridt i denne protokol er hovedsageligt relateret til håndtering af hjernevævet og den nødvendige tid til at fuldføre eksperimentet. Det er bydende nødvendigt at håndtere hjernevævet forsigtigt for at bevare strukturen og funktionen af ependymale cilier samt at reducere trauma den skrøbelige væv. Vigtigere, og for at undgå forringelse og død hjernevævet, som kunne være en begrænsende faktor for succes i denne teknik, er det stærkt anbefalesd at trinnene til denne teknik udføres på så tæt på en time som muligt. Imidlertid kunne denne begrænsning overvindes i fremtiden med de fremskridt inden for dyrkning og voksende ependymale eller lignende celletyper med motile cilier in vitro eller med brug af alternative nærende medier. Anvendelse af alternative næringssubstratpulver såsom aCSF og Earles salte til inkubation af hjernen skiver er blevet demonstreret i litteraturen 5. Men i vores hænder, brug af DMEM / High-Glucose var mere fordelagtig end aCSF muligvis på grund af tilstedeværelsen af høje mængde glucose (4.500 mg / ml) i mediet som en potentiel energikilde. Således er det vigtigste kriterium, der anvendes til at vurdere levedygtigheden af vævet, og dermed gyldigheden af tilgangen vurderer cilier slå, da dette er et repræsentativt tegn på levende celler.
Live-billeddannelse af ependymale cilier tilbyder et kraftfuldt værktøj til at analysere nedstrøms signalveje af cilier aktiveringsåsom calcium signalering og svingninger. For eksempel ved hjælp levende fluorescens billeddannelse, det er påvist, at uanset ependymale celle / cilia type, der ependymceller præget af en enestående calcium svingning egenskaber 10. Alt i alt, denne protokol er relevant for både grundlæggende videnskabelige viden og klinisk praksis. Fra den grundlæggende videnskab perspektiv denne teknik giver en vurdering af de funktionelle og fysiologiske roller ependymale cilier struktur, funktion og nedstrøms mekanistiske signalveje. Fra den kliniske praksis perspektiv denne metode er yderst relevant for søgningen efter narkotika, der er målrettet ependymale cilier som en ny terapeutisk mål for neurologiske lidelser såsom hydrocephalus og alkoholmisbrug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18 x 18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24 x 60 mm2 | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
