Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Ce travail décrit la synthèse d'un non-émissive, cyclometalated Ir (III), Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), qui déclenche un signal phosphorescent rapide, longue durée de vie quand elle est coordonnée à une histidine contenant une protéine immobilisée sur la surface d'une particule magnétique. Synthèse de Ir1, avec des rendements élevés, est complet O / N et implique le fractionnement du parent cyclometalated Ir (III) dimère de chloro-ponté dans deux équivalents de complexe solvaté. Pour confirmer la spécificité, plusieurs acides aminés ont été sondés pour l'activité de coordination lorsqu'il est ajouté à la sonde synthétisée, et seulement histidine ont provoqué une réponse de signal. Utilisation BNT-II, un peptide mimétique ramifié du biomarqueur paludisme Histidine Rich Protein II (Pf HRP-II), la sonde de l'iridium a été validé comme un outil pour la détection HRP-II. Effets de trempe ont été notées dans le titrage BNT-II / Ir1 par rapport à la L-histidine / Ir1, mais ceux-ci ont été attribués à encombrement stérique et triPlet état trempe. Biocouche interférométrie a été utilisé pour déterminer la cinétique en temps réel de l'interaction avec des Ir1 BNT-II. Une fois que le système a été optimisé, la limite de détection de rcHRP-II au moyen de la sonde a été trouvé que 12,8 nM en solution. Lorsque cette protéine est immobilisée sur la surface d'une particule magnétique agarose 50 pm, la limite de détection était de 14,5 nM. La réponse robuste du signal de cette sonde inorganique, ainsi que sa souplesse d'utilisation en solution ou immobilisé sur une surface, peuvent se prêter à l'égard d'une variété d'applications, depuis l'utilisation de l'imagerie diagnostique.
Étiquetage colorimétriques et fluorescente est une méthode importante pour la détection et le suivi des molécules biochimiques et traite 1,2. Les marqueurs fluorescents plus courantes sont de faible poids moléculaire colorants organiques 3,4, mais ces molécules ne disposent pas toujours des propriétés optiques idéales. Les colorants fluorescents sont sujettes à photoblanchiment, ont souvent des petits déplacements de Stokes, et peut avoir excitation se chevauchant et des spectres d'émission. Marquage colorimétrique est souvent obtenue par l'utilisation de marqueurs enzymatiques, qui ont un signal amplifié utile dans la quantification immunologique 5,6. Ces enzymes ont aussi leurs inconvénients, y compris la photosensibilité, des conditions de réaction, et la durée de conservation courte du substrat. Ces propriétés ont tendance à exiger des dosages immunologiques et des méthodes d'étiquetage des protéines à faire dans des conditions bien contrôlées en utilisant des réactifs coûteux.
Complexes de métaux de transition émissives ont été explorés comme une approche d'étiquetage alternatif for détection biochimique. En particulier, cyclometalated Ir (III) a été étudiée dans le contexte de diodes électroluminescentes organiques (OLED) 7-9 oxygène de détection 10, la catalyse 11, et de protéines / cellule coloration 12-14. Photostabilité élevée et l'efficacité quantique font de cette classe de sondes un bon candidat pour la détection de biomolécules 15,16. Il a déjà été constaté que cyclometalated Ir (III) complexes, de la forme [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, se lie irréversiblement histidine et provoquer une réponse de signal bleu-vert 12,17. Ces complexes sont non-émissif dans l'état de solvento, mais lorsque l'histidine déplace les molécules de solvant et se lie au centre métallique, ils libèrent un signal intense phosphorescent après irradiation UV à ondes longues. Ce signal se produit uniquement après substitution de ligand, et est le résultat d'un électron à l'état triplet de détente à l'état du sol à travers l'activation du transfert de charge métal-ligand (3 MLCT) et le ligand transfert centrée (3 LC) 8,15 voies. Ces complexes peuvent potentiellement être utilisés en tant que sondes de détection pour les protéines riches en histidine.
protéines riches en histidine et leurs niveaux de régulation sont importants dans de nombreuses maladies, y compris la cirrhose du foie, le cancer et les troubles thrombique. 18 Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (Pf HRP-II) en particulier, est un biomarqueur bien validé de l'infection du parasite du paludisme. Cette protéine est de 67 kDa et contient 34% d'histidine, la plupart du temps au sein de caractéristiques AHHAHHAAD répétant des motifs 19. Ces répétitions histidine peuvent lier les ions métalliques libres 19 et 20 des complexes hème dans le sang de l'hôte. Pf HRP-II est couramment détectée dans les milieux à faibles ressources en utilisant des tests de diagnostic rapide (TDR) immunochromatographiques, mais ces tests sont souvent inexactes en raison de conditions échantillons, la concentration de biomarqueurs bas, des normes de fabrication pauvres, et la dégradation des anticorps 21.
<p class="Jove_content"> sondes phosphorescents à base de métaux tels que le cyclometalated Ir (III) décrits ci-dessus sont des options intéressantes pour la détection de Pf HRP-II en raison de leur liaison sélective de l'histidine et leurs propriétés stable et efficace émission. Dans ce document, l'utilisation de [Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) pour détecter BNT-II, un peptide mimétique ramifié de Pf HRP-II est exploré 22. Cinétique de cette interaction ont été surveillées en temps réel en utilisant des techniques d'interférométrie biocouche. Le test a également été adapté à un format de type ELISA sur-perle, où les limites de nanomolaires de détection ont été atteints. Ce dosage possède des avantages par rapport ELISA classiques, car il peut être réalisé en moins de deux heures avec des réactifs d'anticorps libre, à la place de la 4-5 h et avec des réactifs biologiques nécessaires ELISA typiques.Comme outils de diagnostic basés microparticules viennent à la pointe de la technologie moderne de diagnostic, la détection de biomolécules cibles directement sur la surface de la particule est un atout majeur. Les méthodes de détection moléculaires classiques, tels que ELISA et PCR, sont avantageux en ce qu'ils peuvent atteindre de très faibles limites de détection 25. Cependant, ces tests nécessitent de vastes et longs protocoles réactifs. Cet essai a été conçu pour imiter les interactions en sandwich de type ELISA sans le temps et des exigences de réactif (Figure 5). En outre, le coût de la sonde Ir1 par échantillon a été estimé à environ un centime, alors que le coût d'anticorps pour un ELISA typique est 0,20-0,30 $ par échantillon.
Depuis les méthodes décrites ci-dessus reposent sur une sonde iridium cyclometalated pour la détection du biomarqueur du paludisme, cette sonde ne serait pas sensible aux modes de défaillance communs à d'autres méthodes de détection (ie. Fluorophore de quenching et la dégradation anticorps / enzyme). Histidine est unique dans ses propriétés de fixation métalliques. Le travail présenté profite de ce phénomène en remplaçant les anticorps dans un sandwich typique ELISA avec des complexes contenant des métaux. Ni (II) de NTA capture rcHRP-II sur la surface de la particule et Ir1 signale la présence de la protéine. L'étape la plus critique dans l'essai est de permettre aux particules magnétiques de se mélanger avec l'échantillon et la sonde. Dans une plaque à 96 puits ELISA, les biomolécules et les réactifs atteindre l'équilibre avec la surface à deux dimensions du fond du puits. Les particules magnétiques ont tendance à s'installer hors de la solution en raison de leur base d'oxyde de fer dense, ce qui réduirait les sites de liaison disponibles. Ainsi, les particules doivent être mélangées pendant le temps d'essai pour assurer la liaison maximale.
Lors de la conception d'un réactif pour le diagnostic de la maladie, il faut garder à l'esprit la forme d'échantillon du patient ainsi que la concentration physiologique du biomarqueur. Pourle paludisme, la concentration de pf HRP-II dans le sang d'un patient peut varier de faible à élevé picomolaire nanomolaire. Bien que ce test est cliniquement pertinente pour les niveaux plus élevés d'infection, la limite de détection doit être améliorée afin de détecter les patients asymptomatiques avec une faible circulation picomolaire pf HRP-II. Dans les procédés décrits ci-dessus, la "mise en marche" signal généré par Ir1 se produit en présence d'histidine. Alors que le biomarqueur paludisme est riche en histidine, d'autres protéines sériques, comme l'albumine sérique humaine et riche en histidine glycoprotéine, seraient provoquent une réponse de signal avec la sonde. Ce serait à son tour conduire à des diagnostics faux positifs. Cela rend la capture de la protéine sur la surface de la particule une étape bénéfique, en ce que la protéine d'intérêt peut être extrait rapidement à partir d'un échantillon de patient. En outre, la conception d'une sonde bifonctionnelle, qui couple un peptide riche en histidine à un élément de reconnaissance moléculaire solide (ie. Aptamère), Pourrait ajouter une autre couche de la spécificité de l'essai. Le peptide serait chargé avec l'iridium avant accouplement afin de l'aptamère. Dans une telle conception, la sonde Ir1 stable peut encore être utilisé, tout en réalisant une spécificité de cible avec l'aptamère. Cela permettrait d'application de la sonde pour détecter la HRP-II natif dans une matrice complexe (p. De plasma ou sang total) et de réduire les effets de liaison non spécifiques. Afin d'améliorer encore le signal de tests de diagnostic rapide, le test pourrait être incorporé dans un système électrochimiluminescent (ECL), où pf HRP-II peut être détecté sur le TDR comme lecture électrochimique 26. Cette sonde d'iridium de la prochaine génération améliorerait grandement notre bourrelet sur-dosage ELISA pour la détection de marqueurs biologiques de la maladie.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |