Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance–prior to or following clinical onset–is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.
Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.
Подробное молекулярная характеристика опухолевых геномов по надежных технологий секвенирования и улучшение данных аналитических инструментов привело к открытию ключевых генетических изменений в конкретных видах рака 1,2. Разработка целевых методов лечения, направленных на этих генетических поражений, таких как HER2, BCR-ABL, EGFR и ALK, значительно улучшили качество жизни пациентов 1,2. Тем не менее, несмотря на специфичность этого подхода, клинический ответ на большинстве одиночных лечения была неоптимальной, как сопротивление, в конечном счете возникает. Недавно значительный прогресс был достигнут в понимании молекулярных основ в устойчивости целевых терапии. Интересно, это становится очевидным, что видный механизм сопротивления включает в себя постоянную цель / активность пути. В случае в точке, андроген рецептор (АР) -directed enzalutamide лечение рака простаты приводит к обогащению активирующих мутаций в самой AR, поддерживая АР сигнализации OUTPут в присутствии ингибитора 3-5. Это знание привело к агрессивной кампании: 1) разработать антагонисты третьего поколения, которые могут продолжать подавлять как WT и функцию мутантного-AR в enzalutamide устойчивостью РПЖ 3 и 2) определить потенциальные вниз по течению узлы АР сигнализации, которые могут быть направлены для терапевтического вмешательства , Аналогично, устойчивость к другим классам ингибиторов, таких как меры, нацеленные на EGFR, BRAF и ABL часто приводят к мутациям, что оживлению оригинальный употреблению киназы 1.
С осознанием того, что сопротивление неизбежно возникает у большинства пациентов, разработке подходов к оперативно довести эти механизмы на свет позволит развитие эффективной последующей терапии. Один подход, который широко используется для анализа геномики клинических резистентных опухолей по отношению к лечебно-наивных или, чувствительными опухолями по выявлению обогащения / истощения в генетических поражений, которые могут быть поддаются DОткрытие ковер. Несмотря на обещания, есть две основные обязательства такого подхода, которые препятствуют быстро открытие. Во-первых, получение своевременного доступа к опухолевого материала для геномной допроса может служить значительным препятствием в переходе от терапии для лечения. Во-вторых, деконволюции множества генетических поражений в устойчивой обстановке может быть сложным, так как опухоли могут представить существенные внутригрупповые опухолевый неоднородность 6,7.
В свете этих проблем, там был увеличен на доклинической зависимость открытия механизмов сопротивления. Этот подход может позволить идентификацию известных механизмов резистентности до клинических испытаний 1, которые могут направлять альтернативные стратегии клинической управления в тех пациентов, которые имеют эти механизмы либо до терапии или следующие начала сопротивления.
Одним из таких инструментов доклинические открытие, что в настоящее время широко используется, чтобы применить объективные функциональные экраны RNAi. Для экзаменаPLE, Уиттакер и его коллеги применили геном масштаба экрана RNAi, чтобы идентифицировать, что потеря НФ1 посредником сопротивление ВВС и MEK ингибиторов на основе устойчивого МАРК активации пути 8. Эти данные были найдены, чтобы быть клинически значимыми, как с потерей функции мутации в NF1 наблюдались в BRAF -mutant опухолевых клеток, которые неразрывно устойчивы к RAF торможения и в опухолях меланомы, устойчивых к Vemurafenib активации 8. Тем не менее, несмотря на успех такого подхода, многие клинически значимых целей, часто не определены, предположительно из-за потери от-функции смещения этого подхода.
В противоположность этому, менее предвзято инструмент для доклинической открытия механизмов резистентности включает в себя генерацию клеточных линий, устойчивых при длительном воздействии интерес соединения в сочетании с NGS основе геномной или транскриптомных профилирования. Этот подход был успешно реализован в несколько групп, чтобы определить спонтанноерецидивирующие одиночные варианты нуклеотид или выражение изменения, которые позволяют сопротивление 5,9,10. Например, рецидивирующий F876L мутация в АР было недавно обнаружено в устойчивых клонов в пробирке 3-5 и ксенотрансплантатов опухолей в естественных условиях 5 до идентификации этой мутации в клинике 4. Совсем недавно, гашиш и его коллеги (2015) 11, используемый ClonTracer в двух клинически значимых моделей, чтобы показать, что большинство устойчивых клонов, которые возникают при длительном воздействии наркотиков были частью уже существующей субпопуляции предположить, что наиболее функционально отношение мутации, скорее всего, уже существовавших ранее которые становятся выбраны для при выборе 11.
В отличие от геномной профилирования опухолей, обсуждаемых ранее, этот подход выгоды от менее неоднородности как "гомогенные" резистентные клоны используются для анализа содействия более точное генетическое рассечение потенциальных водителей. Furthermруда, возбуждающе, в дополнение к возможности для выявления механизмов резистентности, этот метод может также применяться для идентификации клеточных механизмов действия и целевые биоактивных малых молекул, для которых эта информация неизвестна 10. Учитывая явные преимущества и многократное использование этого подхода, здесь мы приводим протокол с подробным успешной реализации такого доклинических экране, чтобы максимизировать потенциал для клинически значимых открытий.
Selection of cell line(s): Characterization of genetic state and genomic instability
Undoubtedly, the single most critical factor in successfully uncovering clinically relevant resistance mechanisms is the initial cell line selection. Two factors should be considered. First, aim to select cell line(s) of the same lineage/subtype harboring the defining genetic traits of the disease (e.g., BRAFV600E in melanoma). Interrogation of publically available transcriptomic and mutation data for both cell lines30-32 and primary/metastasis tumors for a variety of indications33,34 will facilitate the selection process. Although identification of cell lines with clinically relevant genetic alterations is ideal, in some instances this may not be possible due to lack of available cell lines or feasible due to factors such as difficulty and length of the screening process.
With regards to the aforementioned point, a second factor to consider then during cell line selection is the ease or feasibility of resistance screening using the desired line. For example, factors such as proliferation and intrinsic mutation rates can greatly impact on the speed of discovery. To this end, cell lines can be utilized with faster growth kinetics and deficient in DNA MMR mechanisms in the hopes that emergence of spontaneous resistance can be accelerated35. Based on the COSMIC database, several candidate cell lines exist with deficiency in one of two frequently mutated MMR genes, MSH2 or MLH1 (Tables 2 and 3). Alternatively, if cell lines of interest do not exist bearing defects in MMR, acute treatment with physical or DNA reactive chemical mutagens such as the alkylating agent N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) can be used to enhance genomic instability. Although both approaches may significantly shorten the time to attain resistant clones and follow-up sequencing, stringent functional testing should be performed on candidate genes as a greater number of non-functional, passenger mutations are likely to emerge. SNVs can be rank ordered to maximize chances for identifying functionally relevant mutations. Firstly, choosing those mutations that are recurrent in independent clones will increase the likelihood these mutations are drivers of resistance. In the event recurrent mutations are not identified, focusing on SNVs that fit the mechanism of action of the drug (for example, the drug target or a known downstream effector of the drug target) may be meaningful. Ultimately, the gold standard is always experimental evaluation of resistance-conferring activity of the candidate SNVs by ectopic cDNA expression in drug-sensitive parental cells.
DNA vs RNA sequencing
Once resistant clones have been generated, DNA and/or RNA can be sequenced depending on the need. DNA sequencing, either exome or whole-genome sequencing, will allow identification of germline and somatic variants, such as SNPs, indels and copy number variants. Whereas the more cost-friendly exome sequencing focuses on generating reads from known coding regions, whole-genome sequencing will generate sequencing data for the entire genome which may facilitate identification of mutations in non-coding elements such as enhancers or miRNAs36. However, since gene expression data is not gauged during DNA sequencing, it is difficult to predict which mutation(s) is likely to be a functional driver. In this regard, sequencing of RNA, although more costly, offers this advantage. The fact that mutation calling is only performed on expressed RNA species enhances the likelihood that the mutation of interest may be a functional driver. In addition to allowing a more focused survey of mutations for follow-up functional testing, RNA sequencing also offers the added advantage of being able to identify gene expression alterations, alternative splicing and novel chimeric RNA species, including gene fusions that may also serve as potent drivers of resistance.
Bioinformatics pipeline
Example commands are provided for illustration purposes, but more detailed documentation and tutorials are available from the Broad Institute16 and should be read thoroughly before beginning NGS analysis. The following commands are designed for a UNIX shell environment on a system on which all tools and reference data have been pre-installed. These commands also assume FASTQ files containing paired-end sequence reads from two samples, named "parental" and "resistant," have been received from the vendor and placed in the "data" directory. In most cases these commands should be adapted or optimized for a specific application using additional command-line arguments (e.g., adding "-t 8" to the bwa command allows multithreaded operation across 8 CPU cores). Read groups (which assign alignments to biological samples), must often be added to BAM files even if there is only one sample per bam file, in order to comply with file format requirements for certain tools. Read group parameters RGID, RGSM, RGPL, RGPU, and RGLB can be arbitrary strings describing the sample name, sequencing platform, and library strategy.
In vitro vs in vivo assays
Although several resistance mechanisms identified by in vitro selection have been verified to be clinically relevant, there exists a possibility that the mechanisms may not serve as relevant or predominant mechanisms of clinical resistance. One reason for this may include an essential role for the micro-environment in driving resistance to therapy, a component that is devoid in the experimental protocol/setup discussed thus far. Indeed, several studies have shown that anti-cancer agents that are capable of killing tumor cells are rendered ineffective when the tumor cells are cultured in the presence of stromal cells implying innate mechanisms of resistance conferred by the stroma37,38. To identify such stroma-induced acquired resistance mechanisms, one may consider performing in vitro co-culture or in vivo tumor resistance assays. Since the former assay is quite complex, many have resorted to generating drug-resistant tumor xenografts to address the potential role of the stroma in driving resistance. Such studies have uncovered both identical5 and unique39 mechanisms of resistance relative to in vitro selection, implying that the stroma may indeed play a role in the latter. However, one must be mindful of the length of time it may take to generate such resistant tumors and the complexity of the follow-up genomic analysis-complexities due to the intra-tumoral molecular and cellular heterogeneity.
Target identification
In addition to uncovering drug resistance mechanisms, this NGS-based genomic profiling approach can also be applied to identify cellular targets of chemical probes. Historically, multiple unbiased methods have been used to identify the cellular mechanisms of action and targets of low-molecular weight chemicals with biological activities, including affinity purification coupled with quantitative proteomics, yeast genomic methods, RNAi screening, and computational inference approaches40. As an extension to elucidation of drug-resistance mechanisms using NGS-based genomic or transcriptomic profiling of phenotypically resistant cell populations, identification of unique recurrent single nucleotide variations (SNVs) or expression alterations that enable resistance can offer insights into functional cellular targets of compounds. This is based on the idea that a subset of resistance mechanisms observed may involve recurrent mutations in genes that encode the direct protein targets of the small molecule. Recently, several reports validated the utility of the approach, particularly by combining with other approaches including large-scale cancer cell line sensitivity profiling, to revealing the cellular targets of small-molecule probes9,10.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge our colleagues at H3 Biomedicine for their feedback during the manuscript preparation.
48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | Expanding clones |
96-well plates | Fisher Scientific | 07-200-588 | Generating GI50 curves |
CellTiter-Glo | Promega | G7572 | Viability testing |
Cloning discs (3 mm) | Sigma | Z374431 | Picking clones |
Sterile forceps | Unomedical | DF8088S | Picking clones |
RNeasy Plus RNA extraction kit | Qiagen | 74134 | Isolating RNA |
Blood and Tissue DNeasy extraction kit | Qiagen | 69581 | Isolating gDNA |
GATK | The Broad Institute | Indel realigner | |
MuTect | The Broad Institute | Paired variant calling tool | |
Oncotator | The Broad Institute | Variant annotation tool | |
MutationAccessor | The Broad Institute | Functional impact prediction tool |