ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産
Summary
A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.
Abstract
High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.
Introduction
遺伝子治療用途のためには、ウイルスタンパク質の発現、トランス遺伝子単独で、または着信ウイルスタンパク質により引き起こされる細胞傷害性および免疫原性の副作用を回避するために非常に重要です。アデノウイルスベクター（ADVが）が広く導入遺伝子発現1,2の影響を調査するために多種多様な細胞に外来DNAを導入するために使用されます。 AdVの最も先進的なバージョンは、3,4、すべてのウイルスコード配列を欠くし、それによって、低免疫原性および低毒性5-8と合わせ35キロバイトまでのパッケージング能力を提供する高容量アデノウイルスベクター（HCAdV）で表されます。その高い包装能力に彼らは、単一のベクター用量を使用して、大規模または複数の導入遺伝子の送達を可能に。したがって、彼らは、研究コミュニティのための貴重なツールを表します。
初段または容易に市販のキットを用いて製造することができる初期遺伝子E1及び/又はE3を欠いている第二世代のAdVとは対照的に、VECTOR HCAdVのゲノム構造とウイルス生産はより複雑です。 HCAdVゲノムを構成するためのシステムは、全てのウイルスコード配列を欠いHCAdVゲノムを有するプラスミドのpAdFTCとシャトルプラスミドpHM5 9-12に基づいています。最大14キロベース（KB）の任意の目的の遺伝子がマルチクローニングサイトは、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位を切断/認識によって隣接されたシャトルベクターpHM5にクローニングすることができるSCE IおよびI-CEU IをPI-そのため、目的のクローニングされた遺伝子は、連続したPI-SCE IとI-CEU私によって解除することができ、プラスミドpAdFTCに含まHCAdVのゲノム中に存在する同じ制限部位に後続導か挿入するためのダイジェスト。 pAdFTCではPI-SCE IとI-CEU私切断部位の間に位置する導入遺伝子の挿入部位は、スタッファーDNAと、そのような5 'および3'逆方向末端反復配列（ITR）としてゲノムパッケージングに必要な非コードアデノウイルス配列が隣接しています終了し5'ITRの下流のパッケージングシグナルの両方で。追加のスタッファーDNAは、ウイルス産生の間に効率的なパッケージングを確保するために、27〜36キロバイトの範囲の最終HCAdVゲノムの最適なサイズを提供します。 pAdFTCには、最大45キロバイト（挿入された導入遺伝子のサイズに依存）を持つ大規模なプラスミドであり、比較的長いDNA認識部位とのホーミングエンドヌクレアーゼの使用が強い結合するDNAを示し、いくつかのクリーンアップ手順は、pHM5から導入遺伝子の転写時に必要ですので、 pAdFTCへ。剪断力を避ける慎重な取り扱いが推奨されます。
HCAdVのゲノムのITRは5'ITRの上流に直接的に配置され、3'ITR 12の下流にNot I制限酵素認識部位に隣接されます。したがって、HCAdV わけではありません、私はHCAdVのプロデューサー細胞株へのウイルスゲノムのその後のトランスフェクションのためにダイジェストによって解除することができます。なお、制限酵素の使用はありません私のrelのためのプラスミドpAdFTCからウイルスゲノムの容易さは、挿入された導入遺伝子ではなく、私のDNA認識部位を欠いていることを意味します。 HEK293細胞ベースのプロデューサー細胞（116細胞）を安定的にCreリコンビナーゼを発現します。ウイルス増幅のために116細胞は 、トランス3,4 で複製およびパッケージングに必要なすべてのADV遺伝子を提供するヘルパーウイルス（HV）と同時感染しています。 HVが116 セル 4内で発現Creリコンビナーゼによるウイルス増幅中に除去されるflox化パッキング信号と第一世代のAdVです。これは、完全なパッケージングシグナルを含む主にHCAdVゲノムがキャプシド化されることが保証されます。
HCAdVの前増幅は、組織培養皿内の表面上に成長させた116細胞における連続継代工程を行うことによって行われます。それぞれの継代後、ウイルス粒子は、3つの連続した凍結融解工程を行うことにより、感染細胞から放出されます。細胞の数を増加させるあらゆる通路はに感染していると前の通路からの細胞溶解物の1/3。最後に、前増幅ステップが、大規模な増幅のためのスピナーフラスコ中の懸濁液中で増殖させたプロデューサー細胞を感染させるために使用されてから最終的に溶解物。ビリオンは、塩化セシウム密度勾配超遠心分離に4,12を行うことにより、懸濁細胞から精製されます。この手順で空の粒子と完全に組み立てられた粒子は、2つの別個の帯域に分割されています。さらにHCAdVを濃縮し、第2の非段階的な超遠心分離工程が実施される粒子。その後HCAdVを含む得られたバンドを回収し、生理的な緩衝液に対して透析します。最終ベクター調製物は、絶対的なウイルス粒子の感染性粒子およびHVの汚染レベルの数に関して特徴付けられます。絶対的なウイルス粒子は、ウイルス粒子を溶解し、260nmの吸光度を測定することにより、または定量的リアルタイムPCR（定量PCR）12を実行することによって決定することができます。 PURの感染ifiedウイルス粒子は、感染した細胞3時間後、感染中に存在HCAdVゲノムを測定するqPCRにより決定することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介するプロトコルは、以前に記載された手順4,12に基づいて、ヒトアデノウイルス5型に基づくHCAdVベクターの精製を可能にします。 pAdFTCプラスミド内HCAdVゲノムは、すべてのアデノウイルス遺伝子を欠いているだけ5'-および3'-のITRおよびパッケージングシグナルを運びます。この戦略では、HV AdNG163R-2 4は、 トランスで 、効率的なウイルス産生に必要なす?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DFG grant EH 192/5-1 (A.E.), the EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), the UWH Forschungsförderung (E.S. and W.Z), and the PhD programme of the University Witten/Herdecke (P.B.). J.L. was supported by a stipend of the Chinese Scholarship council and T.B. and M.G by the Else Kröner-Fresenius foundation (EKFS).
Materials
| I-CeuI | New England Biolabs | R0699S | restriction digest |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | restriction digest |
| T4 Ligase | New Engand Biolabs | M0202S | ligation |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | restriction digest |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | restriction digest |
| Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | dephosphorylation of digested plasmids |
| Hygromycin B | PAN Biotech | P02-015 | selection of CRE expressing 116 cells |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | Hek293T cell culture medium |
| Minimal Essential Medium (MEM) Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116 cell culture medium |
| Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) | PAN Biotech | P04-36500 | washing of cells, resuspension of cells |
| 250 ml storage bottle | Sigma | CLS430281-24EA | infection of 116 cells grown in suspension |
| 500mL PP CentrifugeTubes | Sigma | CLS431123-36EA | sedimentation of cells from suspension culture |
| Spinner flask | Bellco | 1965-61030 | growth of 116 cells in suspension |
| Ultra Clear Ultracentrifuge tubes | Beckmann Coulter | 344059 | density gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| SW-41 rotor | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane | VWR | 132129 | dialysis tubing |
| ready-to-use dialysis cassettes | Thermo | 66383 | dialysis |
| one shot DH10B electrocompetent E. coli | invitrogen | C4040-52 | transformation of ligation reactions |
| PureYield™ Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | midiprep |
| peqGOLD Tissue DNA Mini Kit | Peqlab | 12-3396-02 | isolation of genomic DNA |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | tranfection of 116 cells |
| opti MEM (10 % FBS) | Gibco | 31985-062 | transfection of 116 cells |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 170-8882 | q-PCR |
| CFX 96 C1000 touch | Biorad | qPCR machine | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carl Roth | A156.1 | purification of DNA |
| Cesium chloride | Carl Roth | 8627.1 | density gradient centrifugation |
| sodium acetate 99% | Carl Roth | 6773.2 | DNA precipitation |
| LB medium | Carl Roth | X968.3 | bakterial growth medium |
| ethanol 99,8% pure | Carl Roth | 9065.5 | DNA precipitation and washing |
| SDS 99,5% | Carl Roth | 2326.2 | lysis buffer |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | lysis buffer |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | dialysis buffer/ lysis buffer |
| glycerol 99,5% | Carl Roth | 3783.1 | dialysis buffer |
| MgCl2 98,5% | Carl Roth | KK36.2 | dialysis buffer |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | optional dialysis buffer |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | optional dialysis buffer |
| sucrose | Carl Roth | 9286.1 | optional dialysis buffer |
| Na2HPO4x2H2O | Carl Roth | 4984.2 | optional dialysis buffer |
| 1,5ml tubes | sarstedt | 72,730,005 | storage of virus preparations at -80°C |
Riferimenti
- Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
- Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).
- Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).
- Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).
- Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).
- Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).
- Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).
- Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).
- Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).
- Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).
- Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, (2001).
