İnsan Adenovirüs Tip 5 dayanarak Yüksek Kapasiteli Adenoviral Vektörler klonlanması ve Büyük Ölçekli Üretim
Summary
A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.
Abstract
High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.
Introduction
Gen terapötik uygulamalar için, viral proteinlerin tanımlanması, transgen tarafından ya gelen viral proteinler kaynaklanan sitotoksik ve immünojenik yan etkileri önlemek için büyük bir önem taşımaktadır. Adenovirüs vektörleri (AdV), yaygın olarak transgen ekspresyonu 1,2 etkisini araştırmak için hücreler, çok çeşitli yabancı DNA'nın için kullanılır. AdV en gelişmiş versiyonu tüm viral kodlama dizilerinin 3,4 ve böylece düşük immünojenikliğe ve düşük toksisite 5-8 ile birlikte 35 kb bir ambalajlama kapasitesi sunan yoksun yüksek kapasiteli adenovirüs vektörleri (HCAdV) ile temsil edilir. Sahip oldukları yüksek paketleme kapasitesi tek bir vektör doz kullanılarak büyük veya çok sayıda transgenlerin dağıtılmasına izin. Bu nedenle, araştırma toplum için değerli bir araç temsil etmektedir.
Bunun aksine, VEC birinci veya ikinci kuşak AdV kolayca ticari kitler kullanılarak üretilebilir erken gende, E1 ve / veya E3 yoksun içintor HCAdV genomu yapımı ve virüs üretimi daha karmaşıktır. HCAdV genomlarının yapımı için sistem, bütün viral kodlayıcı sekansların ve mekik plazmidinin pHM5 9-12 yoksun bir HCAdV genomu taşıyan plazmid pAdFTC dayanmaktadır. Kadar 14 kilo bazların (kb) ilgi duyulan herhangi bir gen çoklu klonlama bölgesini tanıma ile takviye edildiği mekik vektörü pHM5 klonlanabilir / homing endonükleazlar siteleri yaran Sce I ve I-Ceu I. PI Bu nedenle, ilgi konusu bir klonlanmış genin üst üste PI Sce I ve I-I Ceu plazmid pAdFTC içinde ihtiva HCAdV genomunda bulunan, aynı restriksiyon sitlerine sonra yönlendirilmiş sokulması için digests serbest bırakılabilir. PAdFTC olarak PI Sce I ve I-CEU I sitesi yarığa arasında bulunan transgen yerleştirme sahası stuffer DNA ve 5 've 3' ters terminal tekrarları genom paketleme için gerekli kodlama yapmayan adenoviral sekansından (ITR) tarafından kuşatılırbiter ve 5'ITR bölgesinin paketleme sinyaline akım aşağı hem de. Ek stuffer DNA virüs üretimi sırasında etkin bir paketleme sağlamak için 27 ile 36 kb arasında değişen nihai HCAdV genomunun en uygun boyutu sağlar. PAdFTC (sokulan transgenin boyutuna bağlı olarak) 45 kb olan büyük bir plasmid ve nispeten uzun DNA tanıma mevkileri ile homing endonükleazlar kullanım olduğu bağlanması güçlü bir DNA, çok sayıda temizlik adım pHM5 gelen transgenin transferi sırasında gerekli olan sergileyen pAdFTC için. Kesme kuvvetleri kaçınarak dikkatli kullanım tavsiye edilir.
HCAdV genomunun ITRler 5'ITR yukarı doğru doğrudan doğruya bulunur ve 3'ITR 12 alt baş Not I sınır enzimi tanıma bölgeleri tarafından takviye edilir. Bu nedenle, HCAdV Not I HCAdV üretici hücre hattı viral genomun daha sonra transfeksiyonu için sindirimi ile serbest bırakılabilir. Not sınırlama enzimi kullanımı değil ben rel içinplazmid pAdFTC viral genomun kolaylığı eklenen transgen Not I DNA tanıma sitelerinin yoksun olduğunu gösterir. HEK293 hücre bazlı üretici hücreler (116 hücreleri) kararlı bir şekilde Cre rekombinaz ifade eder. Virüs amplifikasyonu için 116 hücre trans-3,4 replikasyon ve paketleme için gerekli olan tüm AdV genlerin temin Bir yardımcı virüs (HV) ile birlikte enfekte edilir. HV 116 hücrelerinde 4 olarak ifade edilmiştir Cre rekombinaz virüs amplifikasyonu sırasında uzaklaştırılır floxed paketleme sinyali ile bir birinci kuşak AdV olup. Bu, sağlam bir ambalaj sinyalini içeren, ağırlıklı olarak HCAdV genomları kapsül içine alınır sağlar.
HCAdV Ön amplifikasyon doku kültürü çanakları içinde yüzeyler üzerinde büyümüş 116 hücreleri seri pasajlama aşamaların uygulanması ile gerçekleştirilir. Her geçiş sonrasında viral partiküller üç ardışık dondurma-eritme aşamaların uygulanması ile enfekte olmuş hücrelerden salınırlar. Hücrelerin sayısını artan her geçiş ile enfekte olanÖnceki geçit hücre lizatı 1/3. Son ön amplifikasyon aşaması, büyük ölçekli amplifikasyonu için, dönen bir şişede süspansiyon içinde yetiştirilmiş üretici hücrelerin enfeksiyonu için kullanılır son olarak lizata. Viryonlar 4,12 gradyan sezyum klorür yoğunluğunda ultrasantrifüj gerçekleştirerek süspansiyon hücrelerinden saflaştırılır. Bu prosedür ile, boş parçacıklar ve tam olarak monte parçacıkları iki farklı bantlar ayrılır. Ayrıca HCAdV konsantre ikinci bir sigara kademeli ultrasantrifügasyon adımı gerçekleştirilir parçacıklar. Daha sonra elde edilen bant HCAdV içeren toplandı ve fizyolojik tampon karşı diyaliz edilir. Nihai vektör hazırlıkları mutlak viral parçacıkların, enfeksiyöz partiküller ve HV kirlilik seviyeleri numaralarına göre karakterize edilir. Mutlak viral parçaları viral partikülleri parçalama ve 260 nm'de absorbans ölçülerek ve kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) 12 gerçekleştirilerek belirlenebilir. Pur enfektivitesiified virüs parçacıkları enfekte olmuş hücrelerde 3 saat enfeksiyon sonrası içinde mevcut qPCR ölçüm HCAdV genomlarının belirlenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan protokol daha önce tarif edilen prosedürlere göre 4,12 insan adenovirüs tip 5 göre HCAdV vektörlerinin saflaştırılmasına olanak tanımaktadır. PAdFTC plasmidinin içinde HCAdV genom Tüm adenovirüs genlerin yoksun olan ve 5'- ve 3'- ITR'ler ve paketleme sinyalini taşır. Bu stratejide HV AdNG163R-2 4 trans etkili bir virüs üretimi için gerekli tüm genleri içerir. Veya adeno bağlantılı virüs (AAV) vektörleri tabanlı – Bu, açık bir şekild…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DFG grant EH 192/5-1 (A.E.), the EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), the UWH Forschungsförderung (E.S. and W.Z), and the PhD programme of the University Witten/Herdecke (P.B.). J.L. was supported by a stipend of the Chinese Scholarship council and T.B. and M.G by the Else Kröner-Fresenius foundation (EKFS).
Materials
| I-CeuI | New England Biolabs | R0699S | restriction digest |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | restriction digest |
| T4 Ligase | New Engand Biolabs | M0202S | ligation |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | restriction digest |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | restriction digest |
| Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | dephosphorylation of digested plasmids |
| Hygromycin B | PAN Biotech | P02-015 | selection of CRE expressing 116 cells |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | Hek293T cell culture medium |
| Minimal Essential Medium (MEM) Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116 cell culture medium |
| Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) | PAN Biotech | P04-36500 | washing of cells, resuspension of cells |
| 250 ml storage bottle | Sigma | CLS430281-24EA | infection of 116 cells grown in suspension |
| 500mL PP CentrifugeTubes | Sigma | CLS431123-36EA | sedimentation of cells from suspension culture |
| Spinner flask | Bellco | 1965-61030 | growth of 116 cells in suspension |
| Ultra Clear Ultracentrifuge tubes | Beckmann Coulter | 344059 | density gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| SW-41 rotor | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane | VWR | 132129 | dialysis tubing |
| ready-to-use dialysis cassettes | Thermo | 66383 | dialysis |
| one shot DH10B electrocompetent E. coli | invitrogen | C4040-52 | transformation of ligation reactions |
| PureYield™ Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | midiprep |
| peqGOLD Tissue DNA Mini Kit | Peqlab | 12-3396-02 | isolation of genomic DNA |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | tranfection of 116 cells |
| opti MEM (10 % FBS) | Gibco | 31985-062 | transfection of 116 cells |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 170-8882 | q-PCR |
| CFX 96 C1000 touch | Biorad | qPCR machine | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carl Roth | A156.1 | purification of DNA |
| Cesium chloride | Carl Roth | 8627.1 | density gradient centrifugation |
| sodium acetate 99% | Carl Roth | 6773.2 | DNA precipitation |
| LB medium | Carl Roth | X968.3 | bakterial growth medium |
| ethanol 99,8% pure | Carl Roth | 9065.5 | DNA precipitation and washing |
| SDS 99,5% | Carl Roth | 2326.2 | lysis buffer |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | lysis buffer |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | dialysis buffer/ lysis buffer |
| glycerol 99,5% | Carl Roth | 3783.1 | dialysis buffer |
| MgCl2 98,5% | Carl Roth | KK36.2 | dialysis buffer |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | optional dialysis buffer |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | optional dialysis buffer |
| sucrose | Carl Roth | 9286.1 | optional dialysis buffer |
| Na2HPO4x2H2O | Carl Roth | 4984.2 | optional dialysis buffer |
| 1,5ml tubes | sarstedt | 72,730,005 | storage of virus preparations at -80°C |
Riferimenti
- Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
- Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).
- Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).
- Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).
- Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).
- Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).
- Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).
- Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).
- Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).
- Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).
- Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, (2001).
