L'applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare
Summary
The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.
Abstract
La tecnica qui presentata consente di analizzare in cui il passaggio a proteina bersaglio, o in alternativa una piccola molecola, interagisce con i componenti di un percorso di segnalazione. Il metodo si basa, da un lato, l'espressione inducibile di una proteina specifica per avviare un evento di segnalazione ad un passo definito e predeterminato nella cascata di segnalazione selezionato. Espressione concomitante, invece, del gene di interesse quindi permette al ricercatore di valutare se l'attività della proteina bersaglio espressa si trova a monte oa valle della manifestazione segnalazione avviato, in funzione della lettura del percorso di segnalazione che si ottiene. Qui, la cascata apoptotica è stata selezionata come una via di segnalazione definito per dimostrare la funzionalità del protocollo. I batteri patogeni, come Coxiella burnetii, traslocare proteine effettrici che interferiscono con l'induzione della morte della cellula ospite nella cellula ospite per garantire la sopravvivenza dei batteri nella cella e di promuovere la lorodiffusione nell'organismo. Le C. proteine effettrici burnetii CAEB inibisce efficacemente la morte della cellula ospite dopo l'induzione di apoptosi con luce UV o con staurosporina. Per restringere in cui passo CAEB interferisce con la propagazione del segnale apoptotico, proteine selezionate con ben caratterizzato l'attività pro-apoptotica sono stati espressi transitoriamente in maniera doxiciclina inducibile. Se CAEB agisce a monte di queste proteine, l'apoptosi procederà senza ostacoli. Se CAEB agisce a valle, la morte cellulare sarà inibito. Le proteine di prova prescelti erano Bax, che agisce a livello dei mitocondri e caspasi 3, che è il principale proteasi esecutore. CAEB interferisce con la morte cellulare indotta da espressione Bax, ma non da caspasi 3 espressione. CAEB, pertanto, interagisce con la cascata apoptotica tra queste due proteine.
Introduction
La virulenza di molti batteri patogeni Gram-negativi dipende sistemi di secrezione specializzati di dirottare cellule ospiti eucariotiche. I batteri usano questi sistemi di secrezione di iniettare proteine di virulenza batterica (effettori) nella cellula ospite per modulare una varietà di attività cellulari e biochimici. Lo studio delle proteine effettrici ha fornito non solo straordinario di approfondire alcuni temi fondamentali della ospitanti / patogeno, ma anche nella biologia di base delle cellule eucariotiche 1. Modulazione dell'apoptosi cellula ospite ha dimostrato di essere un meccanismo di virulenza importante per molti patogeni intracellulari, e un certo numero di proteine effettrici modulazione dell'apoptosi sono stati identificati 2-9. Tuttavia, i loro precisi meccanismi molecolari dell'attività rimangono sfuggente in molti casi.
L'apoptosi, una forma di morte cellulare programmata, svolge un ruolo importante nella risposta immunitaria all'infezione 10. Due vie principali che portano alla apoptosi averestati individuati: mira i mitocondri (apoptosi intrinseca) o trasduzione diretta del segnale tramite i recettori di morte cellulare a livello della membrana plasmatica (apoptosi estrinseca). Il percorso di morte cellulare intrinseca o mitocondri-mediata è innescato da segnali intracellulari e prevede l'attivazione di Bax e Bak, due membri pro-apoptotici della famiglia di Bcl-2. Questa famiglia è composta da proteine regolatore pro- ed anti-apoptotici che controllano la morte cellulare 11-14. Attivazione di apoptosi porta a oligomerizzazione di Bax e Bak seguiti da successiva permeabilizzazione della membrana esterna mitocondriale, con conseguente rilascio del citocromo c nel citoplasma. Rilascio del citocromo C avvia attivazione delle caspasi effettrici 3 e 7, attraverso l'attivazione della caspasi 9 nella apoptosoma 15. Questo porta alla proteolisi di substrati selezionate che, tra l'altro, si traduce nella esposizione della fosfatidilserina sulla superficie cellulare 16 e libera un DNasi dedicato che frammenta chromatin 17,18.
Al fine di determinare se all'interno della cascata apoptotica una proteina effettore individuo interferisce, un sistema di espressione inducibile è stato impiegato 19. I sistemi di regolamentazione per l'espressione condizionale di transgeni sono stati uno strumento prezioso nell'analisi funzione di una proteina all'interno della cellula o la sua importanza per il tessuto, organo e organismo sviluppo, così come durante l'iniziazione, progressione e manutenzione della malattia 20-23. Tipicamente, i sistemi di controllo inducibili, come il sistema Tet 24 impiegato qui, formano una unità di trascrizione artificiale (vedi Figura 1). Un componente è un fattore di trascrizione artificialmente ingegnerizzato chiamato tTA (tetraciclina-dipendente trascrizione attivatore), formata dalla fusione della trascrizione repressore batterico TetR 25 ad un dominio proteine di mammiferi che media l'attivazione trascrizionale o silenziamento 24,26. Il secondo componente è un ibridopromoter, chiamato TRE (elemento tetraciclina-sensibile), costituito da un promotore minimo eucariotico, contenente almeno un TATA-box e un sito inizio della trascrizione, unita a più ripetizioni del sito di legame al DNA cognate per TetR, teto 24,25. Il terzo componente è il ligando naturale TetR, tetraciclina o uno dei suoi derivati, come anhydrotetracycline o doxiciclina 25. Su ligando aggiunta al mezzo di coltura, TetR perde la sua affinità per této e dissocia dal TRE. Come risultato, la trascrizione del gene bersaglio è abolito. Espressione del transgene può, pertanto, essere strettamente controllata in maniera tempo e dose-dipendente sia in coltura cellulare e in animali 20,23,24. Con tTA, espressione del transgene verifica costitutivamente, se non in presenza di tetraciclina. Questo può essere uno svantaggio nello studio delle proteine citotossiche o oncogeniche perché tetraciclina deve prima essere rimosso dal sistema, prima transgene expression verifica e gli effetti della proteina bersaglio sulla cellula può essere monitorato. Questo può richiedere molto tempo e non è sempre completa, soprattutto negli animali transgenici 27. Per affrontare questa limitazione, un mutante TetR con una risposta inversa alla presenza di doxiciclina stato utilizzato per generare un nuovo fattore di trascrizione, rtTA (reverse tTA) 28. Si lega solo al TRE e, contemporaneamente, attiva la trascrizione in presenza di doxiciclina. Leakiness residua del sistema, cioè., L'espressione del transgene in assenza del fattore di trascrizione TRE-bound, originario sia (i) da effetti di posizione in un sito di integrazione genomica, (ii) dal TRE sé 29, o (iii) da non -specific legame di tTA / rtTA 28, è stata affrontata introducendo un silenziatore trascrizionale aggiuntivo, denominato TTS (tetraciclina-dipendente silenziatore trascrizionale) 30 al sistema. Si forma una rete dual regolatore insieme rtTA (vedi Figura 1).In assenza di doxiciclina TTS si lega a TRE e attivamente spegne qualsiasi trascrizione rimanente. In presenza di doxiciclina, TTS dissocia da TRE e rtTA si lega contemporaneamente inducendo l'espressione del gene bersaglio. Questo ulteriore livello di rigorosità è spesso necessario per esprimere proteine citotossiche altamente attivi 31-34.
L'utilizzo di questo sistema a doppia regolazione strettamente controllata, la cascata apoptotica può essere iniziato con una fase definita che consente l'analisi di se la data proteina effettrici può interferire con l'induzione di apoptosi. Questo metodo non può essere utilizzato solo per studiare l'attività anti-apoptotica di proteine effettrici batteriche, ma anche per l'espressione inducibile di proteine pro-apoptotica o tossici, o per dissezione interferenze con altre vie di segnalazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molti batteri patogeni porto sistemi di secrezione di secernere o traslocare proteine effettrici batteriche nella cellula ospite. Queste proteine effettrici hanno la capacità di modulare i processi e percorsi nella cellula ospite, permettendo ai batteri di sopravvivere e replicare quanto di rispettiva nicchia intracellulare. Comprendere le attività biochimiche e dei meccanismi molecolari delle proteine effettrici contribuirà ad una migliore comprensione di patogenicità e può aiutare a sviluppare n…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.
Materials
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
Riferimenti
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
- Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
- Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
- Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
- Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
- Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
- Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
- Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
- Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
- Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
- Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
- Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
- Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
- Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
- Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
- Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
- Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
- Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
- Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
- Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
- Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
- Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
- Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
- Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
- Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
- Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
- Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
- Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
- Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
- Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
- Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
- Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
- Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
- Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).
