Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.
The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.
Il movimento preferito di cellule verso un gradiente di concentrazione, noto come chemiotassi, svolge un ruolo importante in processi patologici e fisiologici del corpo. Tali esempi sono la pelle e le mucose guarigione delle ferite 1, morfogenesi 2, infiammazione 3, e la crescita tumorale 4,5. E 'stato anche dimostrato che le cellule tumorali possono migrare attraverso due strategie cellule migratorie individuali e collettive 6. Inoltre, i meccanismi di instabilità diffusionali possono indurre la separazione delle cellule singole o cluster da un corpo / oggetto tumorale e quindi in grado di emigrare verso una fonte di sostanze nutritive e di invadere le zone più ampie e tessuti 7 così.
Inoltre, è stato dimostrato che i meccanismi di migrazione diverse possono essere attivi in 2D e in 3D, a causa di diversi ruoli delle molecole di adesione 8. Pertanto, una mossa per fisiologicamente rilevanti in vitro per indagare motilità cellulare in un measureable e modo semplice è di importanza nella comprensione movimento delle cellule fenomeni 9. Purtroppo, la difficoltà nell'analisi migrazione cellulare, un completo test chemiotassi quantificabile solito richiede un metodo lungo laboriosa, fondata sulla misurazione della motilità cellulare e fenomeni di trasporto modelli imparziale.
Approcci sperimentali passato per indagare chemiotassi cellulari includono la camera di Boyden 10 e il sotto dosaggio agarosio 11. Tuttavia, all'interno di questi primi test, esperimenti di migrazione delle cellule non hanno controllano il movimento in relazione al tempo. Di più, importante, i gradienti di concentrazione usati per gli esperimenti sono stati non ben definiti o completamente compresi mentre solo sostenere la segnalazione per non più di qualche ora. Inoltre, presto chemiotassi tentativi camera limitato la migrazione delle cellule a due dimensioni e non permettono di monitorare la cinetica della migrazione 12. Guardando la camera di Boyden, un saggio finalenon consentirebbe al ricercatore di osservare la migrazione visivamente e non ha potuto differenziare direttamente chemiotassi (movimento direzionale) da chemochinesi (movimento casuale). Inoltre, diverse variabili differenze nella dimensione dei pori e lo spessore delle membrane-reso la camera molto difficile da riprodurre facilmente e nascosti reazione migrante delle cellule di chemochine 13,14.
Con la nuova comprensione di microfluidica, nuove camere e micro-dispositivi sono stati studiati come strumento per indagare locomozione cella in condizioni di flusso interstiziali o chemiotassi 15,16. In questi nuovi dispositivi, sono stati introdotti e studiati, come l'effetto di sollecitazione di taglio su una cella 17,18 nuove metriche cellulari. Purtroppo, le camere chemiotassi microfluidica passati e attuali limitati studi di migrazione cellulare a substrati-an 2D battuta d'arresto importante dal momento che molti processi biologici, tra cui l'invasione delle cellule tumorali e metastasi, e immigrazione cellulare mune, comporta migrazione 3D.
Camere-dove osservazione diretta di una soluzione chemiotattico è in contatto con un gel 3D contenente cellule sono anche stati riportati anche 19,20. Queste camere hanno due scomparti, uno contenente un fattore chemiotattico e una contenente cellule, sono uniti l'uno accanto all'altro in orizzontale 21 o come anelli concentrici 22. Questi sistemi sono puntati nella giusta direzione, ma non mantengono un sistema di chemiotassi per un periodo di tempo prolungato.
Inoltre, i ricercatori hanno esaminato diffusività attraverso membrane di collagene nelle cellule dialisi, nonché la diffusione delle molecole traccianti attraverso campioni di collagene sottoposta a pressione idrostatica 23-25. Alcuni esperimenti di diffusione in gel di collagene affidano a modificazioni fisiche e chimiche del gel utilizzando campi magnetici e incorporazione chimiche 26. Un metodo comune per la modellazione di diffusività in collatessuti azo tati si basa sulla fluorescenza del punto photobleaching continuo. Questo metodo ha rivelato anisotropia nei coefficienti di diffusione di macromolecole nei tessuti collageni orientati. Tuttavia, photobleaching è stato usato nella cartilagine articolare e non collagene matrici. Mentre simile, gli esperimenti di modellazione necessari devono essere effettuati tramite specificamente comprendere il coefficiente di diffusione del gel di collagene. Ancora più importante, i sistemi non utilizzano un metodo per misurare generazione di forza cella.
Sfortunatamente, la maggior parte dei sistemi sembrano mancare uno o due elementi fondamentali per un sistema ideale: il che consente di inseguimento cellulare, una comprensione gradiente di diffusione con un fattore chemiotattico attraverso la matrice, un insieme relativamente semplice con una facilità di riproducibilità, la minimizzazione interazioni cellula-cellula, e la capacità di misurare unità dimensionali per quantificazione (cioè, velocità, forza, concentrazione specifica). Moghe et al. </em> 27 ha proposto un sistema che soddisfaceva la maggior parte di questi requisiti in cui le cellule sono state inizialmente disperse nel gel anziché concentrati sulla superficie del filtro, ma era difficile misurare le forze che la cellula genera.
A questo proposito, vi presentiamo un sistema planare gradiente di diffusione di indagare chemiotassi in una matrice di collagene in 3D, che permette di superare i limiti moderni camera di diffusione dei dosaggi esistenti, che si basa sulla microscopia time-lapse, associato a tecniche di analisi di immagine per la misurazione delle cellule forze in un ambiente 3D. Questo protocollo fornisce un modo semplice, ma innovativo di creazione di una semplice camera di diffusione 3D che può essere usato per studiare chemiotassi 3D in celle diverse.
Le fasi più critiche per esperimenti di diffusione di successo con o senza cellule sono: impostare correttamente il gruppo di forma; sviluppare la manualità necessaria per evitare danni durante l'estrazione dei vetrini idrofobici; garantendo di trovare una buona linea di partenza lineare per calcolare correttamente il coefficiente di diffusione; correggere i calcoli sperimentali di collagene e chemiotattico; utilizzare correttamente del sistema di imaging cellulare dal vivo per assicurare matrice non si secca; e m…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.
Silicone elastomer kit | Dow Corning Corp | 182 SIL ELAST KIT .5KG | a two-part misture with a 10:1 mix |
Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | CMB for 18mm round coverslips |
22mm Glass Coverslip | Fisher Scientific | NC0180281 | Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5 |
Machined aluminum metal cube | |||
Hobby utility knife | X-Acto | X3201 | |
3-(aminopropyl) trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778-5ML | |
Glutaraldehyde | Polysciences, Inc | 00216A-10 | Glutaraldehyde, EM Grade, 8% |
50 ml tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Standard floor model and tabletop centrifuges |
Glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm) |
Forceps | Fisher Scientific | 22-327-379 | Fine Point Forceps |
Cover glasses | Fisher Scientific | 12-518-105A | Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1 |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl | Gelest | SIT8174.0 | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Acetic acid ACS reagent, ≥99.7% |
Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | Hexane |
anhydrous, 95% | |||
Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
High-precision diamond scribing tool | Lunzer | PV-081-3 | Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length |
Vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5C | High-Vacuum Grease |
15 ml tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface |
10X phosphate buffered solution | Fisher Scientific | BP399-500 | 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer |
1N sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 38215 | Sodium hydroxide concentrate |
Collagen I, rat tail | BD Biosciences | 354236 | Rat tail |
Micro centrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-332 | Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped |
Carboxylate-modified microspheres | Invitrogen | F-8813 | Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids |
Rhodamine | Sigma-Aldrich | 83689 | Rhodamine B for fluorescence |