Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

Summary

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Abstract

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Introduction

Il movimento preferito di cellule verso un gradiente di concentrazione, noto come chemiotassi, svolge un ruolo importante in processi patologici e fisiologici del corpo. Tali esempi sono la pelle e le mucose guarigione delle ferite ^1, morfogenesi ^2, infiammazione ^3, e la crescita tumorale ^4,5. E 'stato anche dimostrato che le cellule tumorali possono migrare attraverso due strategie cellule migratorie individuali e collettive ^6. Inoltre, i meccanismi di instabilità diffusionali possono indurre la separazione delle cellule singole o cluster da un corpo / oggetto tumorale e quindi in grado di emigrare verso una fonte di sostanze nutritive e di invadere le zone più ampie e tessuti ⁷ così.

Inoltre, è stato dimostrato che i meccanismi di migrazione diverse possono essere attivi in 2D e in 3D, a causa di diversi ruoli delle molecole di adesione ^8. Pertanto, una mossa per fisiologicamente rilevanti in vitro per indagare motilità cellulare in un measureable e modo semplice è di importanza nella comprensione movimento delle cellule fenomeni ^9. Purtroppo, la difficoltà nell'analisi migrazione cellulare, un completo test chemiotassi quantificabile solito richiede un metodo lungo laboriosa, fondata sulla misurazione della motilità cellulare e fenomeni di trasporto modelli imparziale.

Approcci sperimentali passato per indagare chemiotassi cellulari includono la camera di Boyden ¹⁰ e il sotto dosaggio agarosio ^11. Tuttavia, all'interno di questi primi test, esperimenti di migrazione delle cellule non hanno controllano il movimento in relazione al tempo. Di più, importante, i gradienti di concentrazione usati per gli esperimenti sono stati non ben definiti o completamente compresi mentre solo sostenere la segnalazione per non più di qualche ora. Inoltre, presto chemiotassi tentativi camera limitato la migrazione delle cellule a due dimensioni e non permettono di monitorare la cinetica della migrazione ^12. Guardando la camera di Boyden, un saggio finalenon consentirebbe al ricercatore di osservare la migrazione visivamente e non ha potuto differenziare direttamente chemiotassi (movimento direzionale) da chemochinesi (movimento casuale). Inoltre, diverse variabili differenze nella dimensione dei pori e lo spessore delle membrane-reso la camera molto difficile da riprodurre facilmente e nascosti reazione migrante delle cellule di chemochine ^13,14.

Con la nuova comprensione di microfluidica, nuove camere e micro-dispositivi sono stati studiati come strumento per indagare locomozione cella in condizioni di flusso interstiziali o chemiotassi ^15,16. In questi nuovi dispositivi, sono stati introdotti e studiati, come l'effetto di sollecitazione di taglio su una cella ^17,18 nuove metriche cellulari. Purtroppo, le camere chemiotassi microfluidica passati e attuali limitati studi di migrazione cellulare a substrati-an 2D battuta d'arresto importante dal momento che molti processi biologici, tra cui l'invasione delle cellule tumorali e metastasi, e immigrazione cellulare mune, comporta migrazione 3D.

Camere-dove osservazione diretta di una soluzione chemiotattico è in contatto con un gel 3D contenente cellule sono anche stati riportati anche ^19,20. Queste camere hanno due scomparti, uno contenente un fattore chemiotattico e una contenente cellule, sono uniti l'uno accanto all'altro in orizzontale ²¹ o come anelli concentrici ^22. Questi sistemi sono puntati nella giusta direzione, ma non mantengono un sistema di chemiotassi per un periodo di tempo prolungato.

Inoltre, i ricercatori hanno esaminato diffusività attraverso membrane di collagene nelle cellule dialisi, nonché la diffusione delle molecole traccianti attraverso campioni di collagene sottoposta a pressione idrostatica ^23-25. Alcuni esperimenti di diffusione in gel di collagene affidano a modificazioni fisiche e chimiche del gel utilizzando campi magnetici e incorporazione chimiche ^26. Un metodo comune per la modellazione di diffusività in collatessuti azo tati si basa sulla fluorescenza del punto photobleaching continuo. Questo metodo ha rivelato anisotropia nei coefficienti di diffusione di macromolecole nei tessuti collageni orientati. Tuttavia, photobleaching è stato usato nella cartilagine articolare e non collagene matrici. Mentre simile, gli esperimenti di modellazione necessari devono essere effettuati tramite specificamente comprendere il coefficiente di diffusione del gel di collagene. Ancora più importante, i sistemi non utilizzano un metodo per misurare generazione di forza cella.

Sfortunatamente, la maggior parte dei sistemi sembrano mancare uno o due elementi fondamentali per un sistema ideale: il che consente di inseguimento cellulare, una comprensione gradiente di diffusione con un fattore chemiotattico attraverso la matrice, un insieme relativamente semplice con una facilità di riproducibilità, la minimizzazione interazioni cellula-cellula, e la capacità di misurare unità dimensionali per quantificazione (cioè, velocità, forza, concentrazione specifica). Moghe et al. </em> ²⁷ ha proposto un sistema che soddisfaceva la maggior parte di questi requisiti in cui le cellule sono state inizialmente disperse nel gel anziché concentrati sulla superficie del filtro, ma era difficile misurare le forze che la cellula genera.

A questo proposito, vi presentiamo un sistema planare gradiente di diffusione di indagare chemiotassi in una matrice di collagene in 3D, che permette di superare i limiti moderni camera di diffusione dei dosaggi esistenti, che si basa sulla microscopia time-lapse, associato a tecniche di analisi di immagine per la misurazione delle cellule forze in un ambiente 3D. Questo protocollo fornisce un modo semplice, ma innovativo di creazione di una semplice camera di diffusione 3D che può essere usato per studiare chemiotassi 3D in celle diverse.

Protocol

1. 3D Mold Design e parti di ricambio Muffa Prima di lavorare, di ottenere un kit di elastomero siliconico, una camera di imaging cellulare dal vivo, un vetrino di vetro di 22 mm e un cubo di metallo alluminio lavorato con dimensioni 10,07 millimetri x 3,95 millimetri x 5,99 millimetri. Preparare la camera di cellule vive per stampaggio ponendo il vetrino nel supporto inferiore e montaggio del resto della camera come indicato dal produttore. Successivamente, utilizzando una pinza, posiziona…

Representative Results

La capacità di questo test per valutare con precisione la migrazione della cella si basa su una buona configurazione del sistema. Pertanto, è fondamentale per fare in modo di progettare lo stampo sistema di diffusione in modo accurato e fare molta attenzione nel porre coprioggetto sia idrofobe e idrofile, come illustrato nella figura 1. Se il sistema è correttamente progettato e durante la fase di modellazione diffusione garantendo trovare molto buona linea di partenza lineare, si è in grado di ragg…

Discussion

Le fasi più critiche per esperimenti di diffusione di successo con o senza cellule sono: impostare correttamente il gruppo di forma; sviluppare la manualità necessaria per evitare danni durante l'estrazione dei vetrini idrofobici; garantendo di trovare una buona linea di partenza lineare per calcolare correttamente il coefficiente di diffusione; correggere i calcoli sperimentali di collagene e chemiotattico; utilizzare correttamente del sistema di imaging cellulare dal vivo per assicurare matrice non si secca; e m…

Materials

Silicone elastomer kit	Dow Corning Corp	182 SIL ELAST KIT .5KG	a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	CMB for 18mm round coverslips
22mm Glass Coverslip	Fisher Scientific	NC0180281	Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife	X-Acto	X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane	Sigma-Aldrich	281778-5ML
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc	00216A-10	Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube	Fisher Scientific	14-432-22	Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass petri dish	Fisher Scientific	08-747A	Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm)
Forceps	Fisher Scientific	22-327-379	Fine Point Forceps
Cover glasses	Fisher Scientific	12-518-105A	Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl	Gelest	SIT8174.0
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane	Sigma-Aldrich	296090	Hexane
			anhydrous, 95%
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool	Lunzer	PV-081-3	Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length
Vacuum grease	Dow Corning	14-635-5C	High-Vacuum Grease
15 ml tube	Fisher Scientific	14-959-49D	15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10X phosphate buffered solution	Fisher Scientific	BP399-500	1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1N sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	38215	Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail	BD Biosciences	354236	Rat tail
Micro centrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-332	Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped
Carboxylate-modified microspheres	Invitrogen	F-8813	Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine	Sigma-Aldrich	83689	Rhodamine B for fluorescence