إجراءات Decellularization من الجرذ الأكباد في تتأرجح ضغط الإرواء الأجهزة
Summary
The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Abstract
Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent liver decellularization have already been published. We aimed to improve the decellularization process by construction of a proprietary perfusion device enabling selective perfusion via the portal vein and/or the hepatic artery. Furthermore, we sought to perform perfusion under oscillating surrounding pressure conditions to improve the homogeneity of decellularization. The homogeneity of perfusion decellularization has been an underestimated factor to date. During decellularization, areas within the organ that are poorly perfused may still contain cells, whereas the extracellular matrix (ECM) in well-perfused areas may already be affected by alkaline detergents. Oscillating pressure changes can mimic the intraabdominal pressure changes that occur during respiration to optimize microperfusion inside the liver. In the study presented here, decellularized rat liver matrices were analyzed by histological staining, DNA content analysis and corrosion casting. Perfusion via the hepatic artery showed more homogenous results than portal venous perfusion did. The application of oscillating pressure conditions improved the effectiveness of perfusion decellularization. Livers perfused via the hepatic artery and under oscillating pressure conditions showed the best results. The presented techniques for liver harvesting, cannulation and perfusion using our proprietary device enable sophisticated perfusion set-ups to improve decellularization and recellularization experiments in rat livers.
Introduction
Decellularization وrecellularization قد تمكن من توليد وظيفية، وأجهزة للزرع في المختبر 1. عن طريق إزالة الخلايا والمواد المستضدات (على سبيل المثال، DNA، الحواتم ألفا غال) من الجهاز، المصفوفة خارج الخلية غير أو أقل مناعة (ECM) ويمكن الحصول على. هذه المصفوفة تحافظ عليه التشريح المجهري ثلاثي الأبعاد للجهاز ويمكن أن تكون بمثابة بايوماتريكس مثالية لإعادة تعمير مع خلايا مختلفة، والأصل ربما xenogeneic 2. وبالتالي، يمكن إسكانها على decellularized الفئران مصفوفة الكبد بخلايا الكبد الإنسان. هذا أنسنة الكبد الجزئي يمكن أن تكون بمثابة نموذج فيفو السابقين للبحث في الأمراض (على سبيل المثال، الأمراض الاستقلابية الخلقية والأمراض الفيروسية أو الأورام الخبيثة) أو لاختبار الأدوية قبل السريرية 3.
وقد تم بالفعل نشر عدة بروتوكولات مختلفة للكبد الفئران نضح decellularization 13/04. في جميع البروتوكولات، decellularوقد تحقق سعودة التي نضح من المنظفات الأيونية أو غير الأيونية القلوية عن طريق الوريد البابي مقنى. إلى حد علمنا، كنا المجموعة الأولى أن يقدم الفئران decellularization الكبد عن طريق نضح انتقائية عبر الوريد البابي و / أو الفئران الشريان الكبدي 14. تمكين نضح الانتقائي للأنظمة الأوعية الدموية المختلفة في الكبد قد تمكن النتائج decellularization أفضل وعلاوة على ذلك، يمكن أن تلعب دورا هاما في إعادة تعمير الخلوية.
في دراسة مفصلة هنا، تم perfused لكبد في جهاز نضح الملكية حسب الطلب، مما نضح تحت ظروف الضغط تتأرجح. هذه الشروط ضغط تحاكي نضح الجهاز التنفسي التي تعتمد فيزيولوجي الكبد: في الوضع الطبيعي، توقف الكبد تحت حباك من الحجاب الحاجز، الذي تنقل خلال التنفس لديها تأثير مباشر على نضح الكبد. إلهام يؤدي خصيصا لتخفيض الضغط على الحجاب الحاجز والكبد، وتحسينأمراض الكبد وريدي تدفق، في حين انقضاء يؤدي إلى ارتفاع في الكبد وخفض الضغط داخل البطن لتحسين تدفق بوابة الوريدي 15.
كان هدفنا لتقييم ما إذا كانت تتأرجح ظروف الضغط يكون لها تأثير على تجانس كبد الفئران نضح decellularization عن طريق محاكاة الظروف داخل البطن خارج الحي. تجانس عملية decellularization قد يكون عاملا في التقليل من نضح decellularization. جميع مواد معروفة تستخدم لdecellularization الكبد سبب تعديلات على ECM. تبقى الخلايا في المناطق ضعيفة perfused لداخل ECM، في حين أن مناطق أخرى هي بالفعل decellularized تماما. لإذابة الخلايا المتبقية، يجب أن تكون مرتفعة مدة نضح أو ضغط، مما تسبب في مزيد من التعديلات على المناطق perfused لجيدا. وبالتالي، منظفات للdecellularization ينبغي توزيع متجانس داخل الجهاز.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن هذه التقنية المقدمة للحصاد كبد الفئران وdecellularization هي استنساخه بسهولة، وهناك بعض الخطوات الحاسمة للنظر:
أثناء التحضير للحصاد الكبد، فمن المهم تجنب نزيف حاد لأنه سيتم تنشيط تجلط الدم ويمكن أن يؤدي إلى تشكل جلطة دمو?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to gratefully thank Steffen Lippert, Khalid Aliyev, Korinna Jöhrens and Katharina Struecker for their help during this project.
Materials
| Self built arterial cannula | |||
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/100 | 0,28mm ID 0,61mm OD |
| Portex Non Sterile Polyethene Tubing | SIMS Portex | REF 800/110/200 | 0,58mm ID 0,96m OD |
| Venodrop Safe butterfly catheter | Fresenius Kabi | 3275851 | 21 G |
| portal vein cannula | |||
| Periphereal Venous Catheter | BD | 393224 | BD Venflon Pro 20G |
| three-way stopcock | smiths medical | 888-101RE | |
| surgery | |||
| Cotton Sticks | Hecht-Assistent | 4302 | |
| Cotton Pads | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | 13H118-03 | |
| Gauze Bandage | Hubei Haige Medical Instruments | 14388 | |
| Ringer Solution | Fresenius Kabi | 13 HKP022 | 1000ml |
| 10ml Syringe | Braun | 4606108V | 10ml/ Luer Solo |
| 5ml Syringe | Braun | 4606061V | 5ml /Luer Solo |
| Suture (Silk 6/0) | Resorba | H1F | LOT 105001.81 |
| medical drape | Shaoxing Zhengde Surgical dressing | D0613011 | |
| surgical instruments | |||
| needle holder | Geuder | 17570 | |
| micro-forceps | Inox-Electronic | 91150-20 | |
| micro-scissors | Martin | 11-740-11 | |
| micro-forceps | S&T | 112314 | |
| Clamp | Aesculap | BH111R | |
| scissors | F S T | 14501-14 | |
| surgical forceps | Aesculap | BD 557 | |
| Decellularisation | |||
| Respirator | Resmed | 14.24.11.0004 | SmartAIR ST |
| Perfusion Device | Charite, medical engineering laboratory | custome-made device | decellularisation device |
| peristaltic pump ismatec reglo ICC | IDEX | ISM4408 | 4-channel |
| heidelberger extension 75 cm | Fresenius Kabi | 2873 | 75 cm |
| MS/CA pump-segment | IDEX | IS 3510 | MS/CA/click'n'go/POM-C |
| CA 2-stopper tube | Pharmed | BPT NSF-51 | |
| bubble trap | custome-made item | ||
| Luer Lock hose connector | Neolab | No. 02-1887 | |
| Detergents | |||
| SDS pellets | Carl Roth | CN30.4 | 2,5 kg |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.1 | 10l |
| PBS | Gibco | 14190-094 | DPBS |
| staining | |||
| Eosin 1% | Morphisto | 10177 | |
| Mayer hematoxylin | AppliChem | A4840 | |
| gomori staining | Morphisto | 11104 | |
| AlcainBlue-PAS staining | Morphisto | 11388 | |
| Direct Red 80 | Sigma Aldrich | 365548 |
Riferimenti
- Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. Liver support strategies: cutting-edge technologies. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Wang, X., et al. Decellularized liver scaffolds effectively support the proliferation and differentiation of mouse fetal hepatic progenitors. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16, 814-820 (2010).
- Shupe, T., Williams, M., Brown, A., Willenberg, B., Petersen, B. E. Method for the decellularization of intact rat liver. Organogenesis. 6, 134-136 (2010).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
- Soto-Gutierrez, A., et al. A whole-organ regenerative medicine approach for liver replacement. Tissue engineering. Part C, Methods. 17, 677-686 (2011).
- De Kock, J., et al. Simple and quick method for whole-liver decellularization: a novel in vitro three-dimensional bioengineering tool. Archives of toxicology. 85, 607-612 (2011).
- Park, K. M., Woo, H. M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).
- Shirakigawa, N., Ijima, H., Takei, T. Decellularized liver as a practical scaffold with a vascular network template for liver tissue engineering. J Biosci Bioeng. , (2012).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver Int. 33, 448-458 (2013).
- Struecker, B., et al. Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions. J Tissue Eng Regen Med. , (2014).
- Struecker, B., et al. Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
