Молекулярная зонд Оптимизация для определения клеток смертности в фотосинтезирующих организмов (<em> Microcystis палочки</em>), Используя проточной цитометрии
Summary
Микробные популяции содержат значительное гетерогенность клеток, которые могут диктовать общее поведение. Анализ молекулярной зонд через проточной цитометрии можно определить физиологические состояния клеток, однако его применение зависит от вида. Это исследование обеспечивает протокол точно определить сотовый смертности в популяции цианобактерии, не преуменьшая или записи ложные положительные результаты.
Abstract
Микробные субпопуляции в полевых и лабораторных исследований было показано, проявлять высокую неоднородность в морфологических и физиологических параметров. Определение в реальном времени состояния микробной клетке выходит за пределы живые или мертвые категорий, как микробы могут существовать в неактивном состоянии, в котором деление клеток и метаболические активности уменьшаются. Учитывая необходимость выявления и количественного определения микробов, проточной цитометрии (FCM) с молекулярными зондами обеспечивает быстрое и точный метод для определения общей жизнеспособности населения. При использовании Sytox зеленый и оранжевый Sytox в модельном цианобактерий Microcystis палочка для обнаружения целостности мембраны, мы разрабатываем передаче метод для быстрого указанием смертности одного элемента. Молекулярные зонды, используемые в этом журнале будет называться зеленым или оранжевым зондов нуклеиновых кислот соответственно (хотя существуют и другие продукты, обладающие аналогичными возбуждения и излучения длин волн, которые имеют сравнимую режимы Actioп, мы специально относятся к выше упомянутых зондов). Протоколы, использующие молекулярных зондов варьироваться между видами, отличаясь в основном в концентрации и инкубационных раз. После этого протокола, установленного на M.aeruginosa зеленый зонд нуклеиновой кислоты была оптимизирована при концентрации 0,5 мкМ после 30 мин инкубации и оранжевой зондом нуклеиновой кислоты в концентрации 1 мкМ, после 10 мин. В обоих зондов концентрации менее, чем указано оптимального привело к отчетности в соответствии с клеток с повреждением мембран. Наоборот, 5 мкМ концентрации и выше в обоих зондов выставлены тип неспецифической окрашивания, в результате чего "живые" клетки, полученные целевой флуоресценции, что приводит к более представления "нежизнеспособных" количества клеток. Положительные контроли (тепловые убитых) при условии, проверяемые мертвую биомассу, хотя целесообразность выработки управления остается предметом обсуждения. Демонстрируя логическую последовательность шагов для оптимизации зеленый и оранжевый зондов нуклеиновых кислот мы, деmonstrate как создать протокол, который может быть использован для эффективного анализа цианобактерий физиологическое состояние.
Introduction
Ячейка представляет собой сложную систему, которая постоянно реагирует на окружающую среду, изменяя физиологические параметры и изменения ее функции. Динамика численности населения изогенных микробных как в природе, и лабораторных зависят от развития субпопуляций, происходящих даже в относительно постоянных условиях окружающей среды 1 – 3. Изменчивость природных микробных сообществ возникает из-за весьма переменной природе условий окружающей среды. Эти иногда стохастические процессы впоследствии производить субпопуляции, которые очень отличаются в среднем населения. Последние данные показали, что эти физиологические субпопуляции по-разному реагируют на условия окружающей среды и может производить соединения сигнальных или ингибиторы, которые существенно повлиять и влияют на общее 3,4 населения.
Создание метода для определения неоднородность в популяции является ключом к ООНderstanding экологию микробов в различных средах и имеет важное значение при создании знания ложных цианобактерий, например, токсического Microcystis, который воздействует в основном на безопасности человека воды. видов, таких как Anabaena отображения морфологическую неоднородность в ответ изменений окружающей среды, разработки специализированных клеток, таких как heterocysts и akinetes 2. В отличие от этого, Microcystis клетки не проявляют очевидную неоднородность морфологического во время стрессовой реакции. Различение жизнеспособных и нежизнеспособных клеток является наиболее важным аспектом физиологической дифференциации и позволяет лучше понять динамику микробных популяций. Однако, концептуальная проблема самой бактериальной жизнеспособности остается сложной и плохо характеризуется 1,5,6.
Проточная цитометрия (FCM) является надежным и быстрым методом анализа отдельных клеток. Для более глубокого понимания одного физио клетоктупой через FCM, молекулярных зондов были использованы, чтобы отличить ряд метаболических и биохимических процессов 7. Это привело к увеличению знания о видах на клеточном и населения уровне и, в свою очередь помогло управление водными ресурсами 8,9. Однако, организмы отличаются по молекулярной поглощения зонда и оттока из-за поры и насосов в клеточных стенок и мембран, которые привели к ряду молекулярного дизайна зонда и реализации протокола 6,10,11. Молекулярные зонды доступны для коммерческих и научных целей часто поставляются с общим протоколом, который может быть применим к очень разного типа клеток. Надо быть очень осторожным в передаче протоколов, разработанных для одного типа клеток в другой 6, поэтому важной задачей для оптимизации молекулярных зондов эффективно перед использованием.
Зеленые и оранжевые зонды нуклеиновых кислот связываются с обеих двухместных и одноместных мель нуклеиновых кислот с минимальной базой выберитеivity и используются для оценки целостности плазматической мембране клеток. Зеленый зонд нуклеиновой кислоты имеет значительно улучшенные сигнала флуоресценции мечения клеток по сравнению с другими молекулярных зондов, таких как пропидийиодидом основе соединений 12, которые могут также действовать в качестве индикатора клеточной жизнеспособности. Термин «Жизнеспособность клеток" здесь подразумевает, что деградация ДНК происходит после потери целостности мембраны плазмы. Зонды нуклеиновых кислот несимметричные цианиновые красители с тремя положительными зарядами и не может проникать в клетки с неповрежденными мембранами под характеризующихся концентрации, в обоих эукариот 11,13 и 14,15 прокариотических организмов. Связывание зонда нуклеиновой кислоты нуклеиновых кислот может привести к до> 500-кратному увеличению выбросов флуоресценции эндогенных сигналов в клетках, которые имеют их целостность мембраны под угрозу. Хотя молекулярных зондов, таких как зеленый зондом нуклеиновой кислоты может быть хорошим индикатором одной физиологии клеток, существует необходимость тО оптимизировать каждый зонд с намеченной целевой организма, а время инкубации менялись от 7 мин – 30 мин и концентрации колеблется от 0,1 мкМ – 0,5 мкм Microcystis экспериментов одна 15 – 19.
Здесь мы приводим протокол, чтобы оптимизировать цитометрии анализы зеленый и относительно новые оранжевые зонды нуклеиновых кислот (которые на сегодняшний день не были проверены на цианобактерий вида M.aeruginosa). Ниже развиты методика может быть передана на другие виды и использовали в качестве платформы для оптимизации протоколов в других молекулярных зондов, тем самым увеличивая понимание микробов и их экологического поведения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Увеличение числа публикаций с использованием молекулярных зондов указывает, что надежные и информативные данные могут быть получены 5,6,8 – 15,19,22,23. Пока еще нет идеально пятно для жизнеспособности клеток, которые могут быть эффективными во всех видах с той же концентра?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность аспирант Дэйв Хартнелл и Борнмут университет для поддержки и финансирования исследований и удобствам.
Materials
| Cyanobacteria Media | Sigma-Aldrich | C3061-500ML | BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution) |
| Decontamination Fluid | BD Biosciences | 653155 | Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 µL/min. Followed by 2mins of sheath H2O. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | N/A (by request) | BD Accuri C6 |
| SYTOX Green | Life Technologies | S7020 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
| SYTOX Orange | Life Technologies | S11368 | Nucleic acid stain – 5mM solution in DMSO |
Riferimenti
- Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues. Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).
- Adams, D. G., Duggan, P. S. Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria. New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).
- Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior. Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).
- Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures. Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry. Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).
- Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).
- Shapiro, H. M. Chapter 7, Parameters and Probes. Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).
- Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., Köster, O., Egli, T. Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes. Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).
- Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology. Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).
- Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria. Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).
- Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton. J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain. Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).
- Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana. Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).
- Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment. Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).
- Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria. Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).
- Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain. Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).
- Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis. Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).
- Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations. Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).
- Bouchard, J. N., Purdie, D. A. Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis. J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).
- Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. Enumeration of Natural Microcystis Populations. Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).
- Marie, D., Simon, N., Vaulot, D., Andersen, R. A. Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry. Algal culturing techniques. , 253-268 (2005).
- Assunçao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae. Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).
- Davey, H. M., Kell, D. B. Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses. Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).
- Franklin, D. J. Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division?. J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).
- Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting. Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).
- Waggoner, A., Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. Fluorescent probes for cytometry. Flow cytometry and sorting. , 209-225 (1990).
- Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. "Sleeping Beauty": Quiescence in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).
- Keer, J. T., Birch, L. Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability. J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).
