O tecido triturado em Compressed Collagen: Um BioTransplant contendo celular para o reparo Reconstructive Single-encenado

Summary

A engenharia de tecidos muitas vezes inclui expansão in vitro, a fim de criar auto-enxertos para regeneração de tecidos. Neste estudo, um método para a expansão do tecido, a regeneração, e a reconstrução in vivo, foi desenvolvida de modo a minimizar o processamento de materiais biológicos e as células fora do corpo.

Abstract

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Introduction

A maioria dos estudos de engenharia de tecidos de transplante da pele e do tracto urogenital incluem colheitas de células autólogas a partir de tecido saudável e a expansão das células em instalações de cultura de células especialmente equipados ^1,2.

Após a expansão das células, as células são geralmente armazenadas para utilização posterior quando o paciente está preparado para receber o auto-enxerto. congeladores de azoto permitir o armazenamento a longo prazo a baixas temperaturas de -150 ° C ou inferior. O processo de congelamento deve ser cuidadosa e controlada, a fim de não perder as células. Um risco de morte celular é a cristalização da água intracelular durante o processo de descongelamento, o que pode levar à ruptura das membranas celulares. congelação das células é normalmente realizada por arrefecimento lento e controlado (-1 ° C por minuto), utilizando uma concentração elevada de células, soro fetal de bovino, e sulfóxido de dimetilo. Após descongelação, as células têm de ser processado de novo por remoção do meio de congelamento e cultura em plástico de cultura de células ou umbiomateriais antes da transplantação de volta para o paciente.

Todos os passos mencionados acima são demorado, laborioso, dispendioso e ^3. Além disso, todo o processamento in vitro de células destinados a transplante do paciente são altamente regulamentado e exige pessoal e laboratórios ⁴ bem treinados e credenciados. Ao todo, de obter um processo de fabricação segura e confiável, a técnica só poderia ser criada em um número muito pequeno de centros tecnicamente avançados e uma utilização mais ampla em transtornos cirúrgicos comuns é duvidosa.

A fim de superar as limitações de cultura de células em ambiente de laboratório, o conceito de transplante de tecido moído para a expansão de células in vivo é introduzido usando o próprio corpo como um biorreactor. Para estes fins, os autoenxertos seria de preferência, ser transplantadas em um molde 3D de acordo com a forma que é necessária para a reconstrução final do órgão de interest ^5-7.

Originalmente, a idéia de transplantar epitélio picada foi apresentado por Meek em 1958, quando ele descreveu como epitélio cresce a partir das bordas de uma ferida. Ele demonstrou que um pequeno pedaço de pele iria aumentar as suas margens e, assim, o seu potencial para a expansão de células em 100% por corte da peça duas vezes em direcções perpendiculares (Figura 1) ^8. A teoria tem sido apoiada pelo uso de enxertos de pele de espessura parcial em malha para o transplante de pele ^{9 e} na pele ferida modelos ¹⁰ de cura.

Figura 1:. Teoria Meek De acordo com a teoria de Meek, epitélio cresce a partir das bordas de uma ferida. Ao aumentar a área exposta pela tecnologia de picagem, tecido moído epithelializes feridas de vários pontos.

O presente estudo é baseado no hipotese de que o mesmo princípio pode ser aplicado ao tecido subcutâneo, colocando epitélio picada em torno de um molde. As células epiteliais que mobilizar de transplantes de picada (reorganizar), cobrir as áreas de feridas (migrar) e divisão (expansão), a fim de formar um neoepithelium contínua que cobre a área da ferida e separa o corpo estranho (o molde) do corpo interior ( Figura 2).

Figura 2:. Dos desenhos animados de um molde 3D ​​com epitélio picada para a expansão de tecidos in vivo intracorporal de acordo com a teoria de Meek Usando tecido moído colocado sobre um molde e, em seguida transplantadas para o tecido subcutâneo, a hipótese é a de que as células epiteliais migrar a partir da bordos do tecido moído, reorganizar, e expandir de modo a formar um neoepithelium contínua que cobre a área da ferida e separa o corpo estranho (o molde) a partir do corpo interior.

Embora estudos anteriores in vivo mostram resultados promissores, mais melhorias poderia ser alcançado através do reforço da auto-enxertos para que o epitélio regenerado poderia suportar trauma mecânico melhor ^7. Para esses fins, foram identificados requisitos importantes para um biomaterial de sucesso, tais como: fácil difusão de nutrientes e produtos residuais, possibilidade de molde de uma maneira 3D e facilidade de manipulação cirúrgica. Conclusões foram feitas que essas necessidades podem ser satisfeitas através da adição de um biomaterial compósito para o tecido moído.

O presente estudo visa o desenvolvimento de um andaime composta de tecido picada em colágeno plástico de comprimido contendo um núcleo de reforço de um tecido biodegradável. Por estes meios, as células viáveis ​​pode migrar das partículas O tecido triturado e proliferar com características morfológicas características originais do epitélio (pele ou urotélio). Utilização de compressão de plástico, o andaime foi reduzird em tamanho de 1 cm a cerca de 420 uM como as partículas foram picados envolto em colagénio da camada superior. O pano de núcleo pode ser qualquer polímero, mas precisa ser modificado com uma superfície hidrófila de modo a interligar com a cobertura ¹¹ camadas de colagénio.

O método forneceu um andaime integridade melhorada através da incorporação de uma malha tricotada que consiste em poli (ε-caprolactona) (PCL) no prazo de dois géis de colagénio de plástico comprimida usando-o como um andaime para a cultura de mucosa da bexiga picada ou picada da pele de porcos. A construção foi mantida em condições de cultura de células durante até 6 semanas in vitro, demonstrando a formação bem sucedida de um estratificado em camadas múltiplas urotélio ou epitélio escamoso da pele no topo de uma construção híbrida bem consolidada. O constructo foi fácil de manusear e pode ser suturado no lugar para fins de aumento de bexiga ou recobrimento de defeitos da pele. Todas as partes do andaime de tecido são aprovados pela FDA ea técnicapoderia ser usado para procedimentos de estágio único pela colheita de tecidos, picagem, compactação de plástico, e transplante de volta para o paciente como uma intervenção single-encenado. O procedimento pode ser realizado para a expansão do tecido e reconstrução em condições estéreis em qualquer unidade de cirurgia geral.

Protocol

Todos os protocolos de animais foram pré-aprovados pelo Comitê County a Estocolmo em animais e todos os procedimentos conformes com os regulamentos para o uso de animais, bem como leis federais relevantes. 1. Procedimentos de Animais Preparando o animal para a cirurgia Preparar a mesa cirúrgica com todos os materiais e instrumentos necessários para a operação em condições de esterilidade. Realizar a cirurgia exclusivamente sob condições estéreis, para reduzir o…

Representative Results

Este estudo apresenta um método que mostra como produzir um biomaterial para transplante usando compressão de plástico de colágeno e tecido picada. Mucosa da bexiga e da pele pode ser colhida e, em seguida, triturada mecanicamente em partículas pequenas (Figura 3). Por compressão de plástico, as partículas trituradas são incorporados dentro do andaime compósito composto por um polímero biodegradável colocado centralmente que é mecanicamente forte dentro de camad…

Discussion

Este estudo apresenta uma abordagem easy-to-use para produzir manchas de parede da bexiga com tecido autólogo para o transplante na mesa cirúrgica. As manchas são formados pela combinação de um tricô polímero biodegradável no meio e colagénio com e sem tecido moído nas superfícies exteriores em combinação com compressão de plástico. Compressão plástica é um método previamente descrito por outros autores e pode ser definido como uma expulsão rápida do fluido a partir de géis de colagénio ^12,13…

Materials

Silicone catheter 10-French			Preparing the animal for surgery , Section 1
DMEM 10X	Gibco	31885-023	Plastic compression section 4
24 well plates	Falcon	08-772-1	Plastic compression section 4
3'3,'5-Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	IRMM469	In vitro culture; Section 5
4% PFA	Labmed Solutions	200-001-8	Immunocytochemistry; Section 6
70% ethanol	Histolab		Immunocytochemistry; Section 6
ABC Elite kit: Biotin -Streptavidin detection kit	Vector	PK6102	Immunocytochemistry; Section 6
Absolute ethanol	Histolab	1399.01	Immunocytochemistry; Section 6
Adenine	Sigma-Aldrich	A8626	In vitro culture; Section 5
Atropine 25 μg/kg	Temgesic, RB Pharmaceuticals, Great Britain		Preparing the animal for surgery , Section 1
Azaperone 2 mg/kg	Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria		Preparing the animal for surgery , Section 1
Biosafety Level 2 hood			Plastic compression; Section 4
Blocking solution:  Normal serum from the same species as the secondary secondary antibody was generated in.	Vector	The blocking solution depends of the  origin of  first antibody	Immunocytochemistry; Section 6
Buprenorphine 45 μg/kg	Atropin, Mylan Inc, Canonsburg, PA		Preparing the animal for surgery , Section 1
Carprofen 3 mg/kg	Rimadyl, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Chlorhexidine gluconate	Hibiscrub 40 mg/mL, Regent Medical, England		Preparing the animal for surgery , Section 1
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	In vitro culture; Section 5
Coplin jar: staining jar for boiling	Histolab	6150	Immunocytochemistry; Section 6
Stainless mold  (33x22x10 mm) custom made			Plastic compression; Section 4
DMEM	Gibco	3188-5023	Plastic compression section 4. Keep on ice  when using it in plastic compression
Epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	In vitro culture; Section 5
Ethilon (non-absorbable monofilament for skin sutures)	Ethicon		Surgery, Section 1
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10437-036	Plastic compression section 4
Forceps (Adison with tooth)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Gauze (Gazin Mullkompresse)			Preparing the animal for surgery , Section 1
Ham´s F12	Gibco	31765-027	Plastic compression section 4
Hematoxylin	Histolab	1820	Immunocytochemistry; Section 6
Humidity chamber	DALAB		Immunocytochemistry; Section 6
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	In vitro culture; Section 5
Hydrogen peroxide Solution 30%	Sigma-Aldrich	H1009	Immunocytochemistry; Section 6
Insulin	Sigma-Aldrich	I3536	In vitro culture; Section 5
Isoflurane	Isoflurane, Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lidocaine 5 mg/ml	Xylocaine, AstraZeneca, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Lucose 25 mg/mL	Baxter, Deerfield, IL		Preparing the animal for surgery , Section 1
Marker pen pap pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Immunocytochemistry; Section 6
Medetomidine 25 μg/kg	Domitor, Orion Pharma, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
Mincing device	Applied Tissue Technologies LLC		Minced tissue preparation, section 2
Monocryl (absorbable monofilament)	Ethicon		Surgery, Section 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Immunocytochemistry; Section 6
NaOH 1N	Merck Millipore	106462	Plastic compression section 4 and cell culture
Nylon mesh, 110 uM thick pore size 0.04 sqmm			Plastic compression; Section 4
Oculentum simplex APL: ointment for eye protection	APL	Vnr 336164	Surgery, Section 1
PBS	Gibco	14190-094	Plastic compression section 4
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Plastic compression section 4
Phenobarbiturate 15 mg/kg	Pentobarbital, APL, Sweden		Preparing the animal for surgery , Section 1
PLGA Knitted fabric			Plastic compression; Section 4
Rat-tail collagen	First LINK, Ltd, UK	60-30-810	Plastic compression section 4, keep on ice
Scalpel blade – 15			Preparing the animal for surgery , Section 1
Shaving shears			Preparing the animal for surgery , Section 1
Stainless stell mesh, 400 uM thick pore size			Plastic compression; Section 4
Steril gloves			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile gowns			Preparing the animal for surgery , Section 1
Sterile drapes
Sterilium	Bode Chemie HAMBURG		Preparing the animal for surgery , Section 1
Suture Thread Ethilon			Preparing the animal for surgery , Section 1
TE-solution (antigen unmasking solution) consist of 10 mM Tris and 1 mM EDTA, pH 9.0			10 mM Tris/1 mM EDTA,  adjust pH to  9.0
Tiletamine hypochloride 2,5 mg/kg			Preparing the animal for surgery , Section 1
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	In vitro culture; Section 5
Trizma Base, H2NC	Sigma-Aldrich	T6066	Immunocytochemistry; Section 6
Vector VIP kit: Enzyme  peroxidase substrate  kit	Vector	SK4600	Immunocytochemistry; Section 6
Vicryl (absorbable braded)	Ethicon		Surgery, Section 1
Tris buffer pH 7.6 (washing buffer)			TE solution: Make 10X  (0,5M Tris, 1,5M NaCl) by mixing: 60,6 g Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 g/mol), add 800 ml  distilled water adjust the pH till 7.6, add 87,7 g NaCl and fill to 1000 ml with  distilled water. Dilute to 1X with distilled water.
X-tra solv (solvent)	DALAB	41-5213-810	Immunocytochemistry; Section 6. Use under fume hood
Zolazepam hypochloride	Zoletil, Virbac, France		Preparing the animal for surgery , Section 1
Depilatory wax strips	Veet		Preparing the animal for surgery , Section 1
Pentobarbital sodium	Lundbeck		Termination, Section 3