Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Summary

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Abstract

Ao lado de hepatócitos do parênquima, o fígado é composto de células não-parenquimatosas (NPC), como as células de Kupffer (KC), células endoteliais do fígado (LEC) e células estreladas hepáticas (HSC). Bidimensional (2D) de cultura de hepatócitos humanos primários (PHH) ainda é considerado como o "padrão de ouro" para testes in vitro do metabolismo do fármaco e hepatotoxicidade. É bem conhecido que a monocultura 2D da PHH sofre de desdiferenciação e perda de função. Recentemente, foi mostrado que NPC hepática desempenham um papel central no fígado (pato-) fisiologia e a manutenção das funções PHH. A investigação actual centra-se na reconstrução de tecidos in vivo pela arquitectura 3d- e co-cultura de modelos para ultrapassar as limitações de monoculturas 2D. Anteriormente, publicou um método para isolar células do fígado humano e investigado o uso destas células para a sua utilização em culturas de células em Biologia Experimental e Medicina ^1. Com base no amplo interesse neste technique o objetivo deste artigo foi o de fornecer um protocolo mais detalhado para o processo de isolamento das células do fígado, incluindo um vídeo, o que permitirá uma fácil reprodução desta técnica.

células de fígado humano foram isoladas a partir de amostras de tecido de fígado humanas de intervenções cirúrgicas por uma técnica de perfusão P EGTA / colagenase em dois passos. PHH foram separadas a partir do APN por uma centrifugação inicial a 50 x g. Densidade passos de centrifugação de gradiente foram usadas para a remoção de células mortas. populações de células de fígado individuais foram isolados a partir da fracção enriquecida NPC usando as propriedades de células específicas e os procedimentos de separação de células. Ao lado do isolamento PHH fomos capazes de separar KC, LEC e HSC para posterior cultivo.

Tomados em conjunto, o protocolo apresentado permite o isolamento de PHH e NPC em alta qualidade e a quantidade de amostra de tecido de um dador. O acesso a populações de células do fígado purificados poderia permitir a criação de in vivo como li humanamodelos Ver.

Introduction

tecido de fígado humano é altamente complexo e consiste em duas entidades diferentes de células, células parenquimatosas e células não-parenquimatosas (NPC). células parenquimatosas do fígado incluem hepatócitos e cholangiocytes. Hepatócitos representam 60 a 70% das células do fígado totais e representam a maioria das funções metabólicas no fígado, por exemplo, ácidos biliares e complementar a síntese de factor de, biotransformação e metabolismo energético ^2,3.

A fracção mais pequena NPC constitui 30-40% do total de células de fígado. NPC incluem diferentes populações de células, ou seja, células de Kupffer (KC), células endoteliais do fígado (LEC) e as células estreladas hepáticas (HSC). Esta fracção de células heterogénea desempenha um papel central em processos fisiológicos do fígado. Além disso, NPC participar na mediação de lesão hepática aguda, por exemplo, lesão hepática induzida por drogas (DILI), assim como em lesões hepáticas crónicas, tais como a cirrose ^4.

Nos últimos anos, hcélulas do fígado uman tornaram-se cada vez mais essencial na pesquisa e desenvolvimento de testes de drogas, o desenvolvimento de drogas e identificação de novos caminhos bioquímicos em doenças do fígado. Para os testes in vitro monoculturas PHH ainda são considerados como o "padrão ouro" ^5. A principal limitação dos modelos actuais homotípicas fígado é desdiferenciação e perda de função dos hepatócitos em poucos dias ^4. O estabelecimento de 3-dimensionais (3D técnicas de cultura) mostrou que estas limitações podem ser compensadas ^4,6. No entanto, mesmo modernas técnicas de cultura 3D não são capazes de exibir todos os modos hepatotóxicos de ações ^7. Faltando populações NPC em modelos in vitro existentes são discutidos como uma possível razão para esta discrepância com a situação in vivo. Tem sido demonstrado que a comunicação célula-célula entre as diferentes populações de células de fígado desempenha um papel central na homeostase fisiológica, mas também em pathophysiologic processa ^8. Portanto, a atenção científica se concentra cada vez mais em NPC e suas interações célula-célula. Seu uso proposital em sistemas de engenharia de tecidos co-cultura e poderia ser uma solução para a elevada procura de modelos in vitro do fígado ^8,9, que são o mais próximo possível da situação in vivo quanto possível.

Atualmente, o principal desafio é o desenvolvimento de um modelo de co-cultura fígado humano padronizado, que contém partes claramente definidas de PHH e NPC. Em consequência, as técnicas de isolamento para as células do fígado muito heterogéneos são necessários e aqueles tem que ser optimizado para obter populações de células puras. Enquanto protocolos padronizados para isolamento PHH existem ^10, o isolamento padronizado de NPC humano ainda está em desenvolvimento. Protocolos de isolamento mais NPC publicados são baseadas em experiências com células não-humanos ^11,12. Apenas algumas publicações descrevem o processo de isolamento do NPC humana e mais cobrem apenasmétodos para o isolamento de um único tipo de célula ^11-16. As características mais importantes de células que foram aproveitadas para a separação de células são de tamanho, densidade, o comportamento de fixação, e a expressão de proteínas de superfície. Na base destas características foi desenvolvido um protocolo simplificado para isolar PHH, KC, LEC e HSC, o qual foi publicado anteriormente em Experimental Biology and Medicine ^1. Por causa do grande interesse nesta técnica, o objectivo deste artigo foi o de fornecer um protocolo mais detalhado para o processo de isolamento de células de fígado incluindo um vídeo, o que permitirá reproduzir a técnica mais facilmente. O protocolo também inclui métodos de controlo de qualidade para avaliação do rendimento e a viabilidade, bem como para a identificação e a pureza avaliação utilizando colorações imunológicas específicas.

Protocol

Nota: Todas as células foram isoladas a partir de tecido do fígado ressecado não-tumoral humana, que permaneceu após a ressecção parcial do fígado com tumores hepáticos primários ou secundários. O consentimento informado dos pacientes foi obtido de acordo com as diretrizes éticas da Charité – Universitätsmedizin Berlim. 1. Preparação de Materiais e Soluções Esterilizar todos os instrumentos e os materiais com antecedência, para evitar a contaminação bacteriana …

Representative Results

A separação em uma fracção parenquimal e não-parenquimatosas, utilizando gradiente de densidade de centrifugação como um procedimento de limpeza combinada com a utilização de propriedades de aderência e MACS leva a PHH bem sucedida e isolamento NPC. PHH e NPC pode ser isolado em alta qualidade e de quantidade. A Figura 1 mostra a configuração representativa do equipamento para a perfusão do fígado e digestão. 10% de FCS foi adicionado à colagenase P conte…

Discussion

O protocolo publicado descreve uma técnica para isolar pura PHH e NPC, nomeadamente KC, HSC e LEC, ao mesmo tempo de alta qualidade e pureza a partir de uma mesma amostra de tecido de fígado humano. A maioria das publicações que tratam de isolamentos de células hepáticas cobrir apenas uma dessas populações de células ^18-20 e procedimentos de isolamento realizados com o tecido humano são raros (revisado por Damm et al.) ^21. Adaptação de métodos estabelecidos com tecido animal <…

Materials

General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 – 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/l) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 – 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G