Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen
Summary
A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.
Abstract
Neben parenchymal Hepatozyten besteht die Leber von nicht-Parenchymzellen (NPC) nämlich Kupffer-Zellen (KC), Leber-Endothelzellen (LEC) und hepatischen Sternzellen (HSC). Zweidimensionale (2D) Kultur von primären humanen Hepatozyten (PHH) gilt bis heute als "Goldstandard" betrachtet für in vitro – Untersuchung von Arzneimittelmetabolismus und Hepatotoxizität. Es ist bekannt, dass die 2D-Monokulturen von PHH von Entdifferenzierung und Funktionsverlust leidet. Kürzlich wurde gezeigt, dass hepatische NPC eine zentrale Rolle in der Leber (patho-) Physiologie spielen und die Wartung von PHH Funktionen. Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Rekonstruktion von di – vivo – Gewebearchitektur von 3D- und Co-Kultur – Modelle , die Grenzen von 2D – Monokulturen zu überwinden. Vorveröffentlichten wir ein Verfahren menschlichen Leberzellen zu isolieren und untersucht um die Eignung dieser Zellen für ihre Verwendung in Zellkulturen in Experimental Biology and Medicine 1. Auf Basis des breiten Interesses an dieser tedas Ziel dieses Artikels chnique war ein detaillierteres Protokoll für den Leberzellisolierungsverfahren einschließlich eines Video zu schaffen, das eine einfache Reproduktion dieser Technik ermöglicht.
Menschliche Leberzellen wurden aus menschlichen Lebergewebeproben von chirurgischen Eingriffen einem zweistufigen EGTA / Kollagenase P Perfusionstechnik isoliert. PHH wurden aus dem NPC durch eine anfängliche Zentrifugation bei 50 x g abgetrennt. Dichtegradientenzentrifugation Schritte wurden zur Entfernung von abgestorbenen Zellen verwendet. Einzelne Leberzellpopulationen wurden aus dem angereicherten NPC-Fraktion unter Verwendung von spezifischen Zelleigenschaften und Zellsortierverfahren isoliert. Neben der PHH Isolation konnten wir KC, LEC und HSC für die weitere Kultivierung zu trennen.
Zusammengenommen können die präsentierten Protokoll die Isolierung von PHH und NPC in hoher Qualität und Quantität von einem Spender Gewebeprobe. Der Zugriff auf gereinigte Leberzellpopulationen könnte die Schaffung von in vivo wie menschliche li erlaubenver-Modelle.
Introduction
Menschliche Lebergewebe ist sehr komplex und besteht aus zwei verschiedenen Zelleinheiten, Parenchymzellen und nicht-parenchymale Zellen (NPC). Parenchymale Leberzellen umfassen Hepatozyten und Cholangiozyten. Hepatozyten repräsentieren 60 bis 70% der gesamten Leberzellen und machen die meisten der metabolischen Leberfunktionen, zB Gallensäure und Komplementfaktor Synthese, Biotransformation und Energiestoffwechsel 2,3.
Je kleiner NPC Fraktion bildet 30-40% der gesamten Leberzellen. NPC umfassen verschiedene Zellpopulationen, nämlich Kupffer-Zellen (KC), Leber-Endothelzellen (LEC) und die hepatischen Sternzellen (HSC). Diese heterogene Zellfraktion spielt eine zentrale Rolle in physiologischen Prozessen der Leber. Ferner nehmen NPC akute Leberschäden bei der Vermittlung, zB arzneimittelinduzierte Leberschädigung (DILI) sowie bei chronischen Leberverletzungen, wie Zirrhose 4.
In den letzten Jahren hUman Leberzellen haben sich mehr und mehr wesentlich in Forschung und Entwicklung von Drogentests, Arzneimittelentwicklung und Identifizierung von neuen biochemischen Wege bei Lebererkrankungen werden. Für di – vitro – Tests PHH Monokulturen sind immer noch als der "Goldstandard" 5 betrachtet. Die Hauptbeschränkung der gegenwärtigen homotypische Leber Modelle Dedifferenzierung , und Funktionsverlust der Hepatozyten innerhalb weniger Tage 4. Die Einrichtung von 3-dimensionalen (3D) Kulturverfahren hat gezeigt , dass diese Einschränkungen 4,6 ausgeglichen werden können. Aber auch moderne 3D – Kulturtechniken sind nicht in der Lage , alle hepatotoxischer Modi der Aktionen 7 angezeigt werden soll . Fehlende NPC Populationen in den bestehenden in vitro – Modelle werden als möglicher Grund für diese Diskrepanz auf die in vivo Situation diskutiert. Es hat sich gezeigt, dass die Zell-Zell Kommunikation eine zentrale Rolle zwischen den verschiedenen Leberzellpopulationen gezeigt in physiologischen Homöostase spielt, sondern auch in pathophysiologic verarbeitet 8. Deshalb ist die wissenschaftliche Aufmerksamkeit konzentriert sich mehr und mehr auf NPC und ihre Zell-Zell-Interaktionen. Ihre gezielte Einsatz in Co-Kultur und Tissue Engineering Systeme könnte eine Lösung für die hohe Nachfrage von di – vitro – Leber – Modelle 8,9 sein , die so nahe an die di – vivo – Situation wie möglich.
Derzeit ist die größte Herausforderung ist die Entwicklung eines standardisierten humanen Leber Co-Kultur-Modell, das klar definierte Abschnitte von PHH und NPC enthält. In der Folge Isolationstechniken für die sehr heterogene Leberzellen benötigt werden und diejenigen müssen optimiert werden, um reine Zellpopulationen zu gewinnen. Während standardisierte Protokolle für die Isolierung PHH 10 vorhanden ist , ist die standardisierte Isolierung menschlicher NPC noch in der Entwicklung. Die meisten veröffentlichten NPC Isolation Protokolle basieren auf Experimenten mit nicht-menschlichen Zellen 11,12. Nur wenige Publikationen beschreiben die Isolierung Prozess der menschlichen NPC und die meisten decken nurVerfahren zur Isolierung von einem Zelltyp 11-16. Die wichtigsten Zelleigenschaften, die für die Zellseparation genutzt wurden, sind Größe, Dichte, Bindungsverhalten und der Expression von Oberflächenproteinen. Auf der Grundlage dieser Eigenschaften entwickelten wir ein vereinfachtes Protokoll PHH, KC, LEC und HSC zu isolieren, die zuvor 1 di Experimental Biology and Medicine veröffentlicht wurde. Aufgrund des breiten Interesses an dieser Technik war es das Ziel dieses Artikels ein detaillierteres Protokoll für die Leberzellisolierungsverfahren, um ein Video mit, die die Technik leichter reproduzieren können. Das Protokoll enthält auch Qualitätskontrollverfahren zur Ermittlung der Ausbeute und Lebensfähigkeit sowie zur Identifikation und Reinheits Auswertung unter Verwendung von spezifischen Immunfärbungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die veröffentlichten Protokoll beschreibt eine Technik zur Isolierung reiner PHH und NPC, nämlich KC, HSC und LEC, gleichzeitig in hoher Qualität und Reinheit aus der gleichen Probe von menschlichem Lebergewebe. Die Mehrzahl der Publikationen mit Leberzellisolationen Umgang decken nur eine dieser Zellpopulationen 18-20 und Isolierungsverfahren mit menschlichem Gewebe durchgeführt sind selten (rezensiert von Damm et al.) 21. Anpassung von Methoden mit tierischem Gewebe etabliert (zB…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Jia Li Liu für ihre Unterstützung bei der Erstellung von Abbildung 1. Diese Studie wurde durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) Projekt Virtuelle Leber unterstützt wurde zu danken: 0.315.741.
Materials
| General Equipment | |||
| PIPETBOY | Eppendorf | ||
| pipettes | Eppendorf | ||
| microscope | Carl Zeiss | ||
| microscope | Olympus | ||
| CO2-incubator | Binder | ||
| Lamin Air | Heraeus | ||
| Centrifuge Varifuge 3.0R | Heraeus | ||
| Urine Beaker | Sarstedt | 2041101 | |
| perfusor syringe 50 ml | B.Braun | 12F0482022 | |
| Bottle Top Filter | Nalgene | 1058787 | |
| Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352070 | |
| Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube | BD Biosciences | 352096 | |
| Tissue Culture plate | BD Biosciences | 533047 | 24 well |
| serological pipettes | BD Biosciences | 357525, 357551, 357543 | 25 ml, 10 ml, 5 ml |
| pipette tips | SARSTEDT | 0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011 | 100 µl, 200 µl, 1000 µl |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Equipment | |||
| water bath | Lauda | ||
| peristaltic pump | Carl Roth | ||
| circulation thermostat | Lauda | ||
| pH meter | Schott | ||
| fine scales | Sartorius | ||
| stand | |||
| Büchner funnel | Haldenwanger | ||
| plastic funnel | |||
| silicone tube | |||
| cannulae with olive tips | |||
| glass dish | |||
| forceps | |||
| scalpel | Feather | 12068760 | |
| Neubauer counting chamber | Optic Labor | ||
| cell lifter | Costar | ||
| Surgical Drape | Charité Universitätsmedizin Berlin | A2013027 | |
| compress | Fuhrmann | 40013331 | |
| sterile surgical gloves | Gammex PF | 1203441104 | |
| Tissue glue | B. Braun | 1050052 | |
| glass bottle | VWR | ||
| Collagenase P | Roche | 13349524 | |
| Percoll Separating Solution | Biochrom | L6145 | Density 1.124 g/ml |
| Hank’s BSS | PAA | H00911-3938 | |
| Dulbecco’s PBS | PAA | H15 – 002 | without Mg/Ca |
| Ampuwa | Plastipur | 13CKP151 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| NaCl | Merck | 1,064,041,000 | |
| KCl | Merck | 49,361,000 | |
| Hepes Pufferan | Roth | 133196836 | |
| EDTA | Sigma | E-5134 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Equipment | |||
| DMEM | PAA | E15-005 | Low Glucose (1 g/l) (without L-Glutamine) |
| HEPES Buffer Solution 1M | GIBCO | 1135546 | |
| L-Glutamine | GIBCO | 25030-024 | 200 mM |
| MEM NEAA | GIBCO | 11140-035 | |
| penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15 – 039 | without L-Glutamine |
| Sodium Pyruvate | GIBCO | 1137663 | 100 mM |
| Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
| William’s E | GIBCO | 32551-020 | |
| with GlutaMAX™ | |||
| EGTA | Sigma-Aldrich | 03780-50G | |
| Fortecortin | Merck | 49367 | 8 mg/2 ml |
| Human-Insulin | Lilly | HI0210 | 100 I.E./ml |
| N-Acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | |
| Fetal calf serum (FCS) | PAA | A15-101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment for Immunostainings | |||
| CD 68 | R&D Systems, USA | monoclonal | |
| CK 19 | Santa Cruz | D2309 | polyclonal |
| CK18 | Santa Cruz | K2105 | monoclonal |
| Vimentin | Santa Cruz | monoclonal | |
| GFAP | Sigma Aldrich | monoclonal | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 23.472-9 | |
| Goat anti-Mouse IgG1-PE | Santa Cruz | C0712 | |
| Goat anti-rabbit IgG-FITC | Santa Cruz | L0412 | |
| Methanol | J.T.Baker | 1104509006 | |
| Formaldehyde 4% | Herbeta Arzneimittel | 200-001-8 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G |
Riferimenti
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