腫瘍特異的内皮細胞の単離および培養拡大
Summary
We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Abstract
新しく単離した腫瘍特異的内皮細胞（TEC）は、腫瘍の血管新生の分子機構を探索し、癌の新規血管新生阻害剤を開発するためのインビトロモデルとしての役割を果たすために使用することができます。しかし、マウスの内皮細胞（EC） の in vitroでの展開での長期起因非ECに表現型の文化のドリフト（内皮-間葉移行）や汚染に困難です。これは容易に培養液中の共精製された線維芽細胞または腫瘍細胞によってoutcompetedされているTECに特に当てはまります。ここでは、コロニーの選択にインビトロで結合された拡張免疫磁気濃縮を利用する高忠実度の分離方法について説明します。このアプローチは、間質細胞または腫瘍細胞の汚染の全く自由である純粋なECの画分を生成します。また、その系譜トレースCdh5のCREを示している：本明細書で説明するプロトコルで使用ZsGreen リットル/秒/リットルレポーターマウスは、セルを検証する貴重なツールですこれらのマウスから単離したECコロニーとして純度は、文化の中で、耐久性と鮮やかなZsGreenの蛍光を示します。
Introduction
内皮細胞（EC）は、固形腫瘍の開発中に必要不可欠です。休眠腫瘍における血管新生スイッチの開始から離れた部位に転移の普及と播種に、ECは、血液を提供導管を形成する酸素および栄養素は、腫瘍増殖1を維持します 。最近示唆したように、ECはまた、灌流独立した機能を有しており、がん幹細胞および他の腫瘍間質細胞2-5の増殖を支持するニッチを形成します。このように、高度に精製された腫瘍特異的EC（TEC） のin vitro培養のための腫瘍血管新生および腫瘍細胞とのクロストークを仲介する新たな分子メカニズムの解明に役立つであろうルーチン機能研究を可能にします。
ECの起源6の組織に応じて高度に専門化しています。異なる腫瘍タイプの不均一な性質及び腫瘍微小環境に、TECはまた、腫瘍特異的分業Oを反映して独自の機能が表示されることがあります血管系F。例えば、異なる種類または腫瘍7,8のグレードから分離されたTECにおける遺伝子発現シグネチャの著しい変動があります。しかし、TECと、特に腫瘍関連線維芽細胞および腫瘍細胞、非ECの同時精製頻繁には、ゲノムワイドな発現解析を混乱することができます。これらの望ましくない細胞型は、TEC培養物のインビトロでの拡大を長期的に依存している研究では特に問題です。
ここで説明するには、一貫して腫瘍および他の組織からの純粋なEC培養を生成し、高忠実度の方法です。 EC画分と共精製された非ECの除去の免疫列濃縮した後、追加のクローニングリングステップは9を使用している純粋なECコロニーをキャプチャします。各コロニーは、非ECを汚染することなく、複数出現継代培養で増殖することができます。また、この方法は、遠藤の研究のための理想的である単一の単離手順、から複数のECクローンをもたらしthelial異質。 ZsGreen リットル/秒/リットルレポーターマウス文化10でZsGreen蛍光を維持する「運命マッピングされた」と消えないマークされたECを生成するための貴重なツールです。また、Cdh5 CREがいることを示しています。プロトコルへの微調整では、この方法は、異なる腫瘍タイプまたは正常組織に適応する必要があります。
Protocol
以下のプロトコルは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校で実験動物医学科によって確立されたガイドラインに従って実施されます。 1.開始する前に、以下の材料および試薬を準備します 50ミリリットルの熱不活性化ウシ胎児血清、50ミリリットルのNu-血清IV、抗生物質 – 抗真菌5ミリリットルと400ミリリットルを低グルコースを補充することにより、ECのメディ…
Representative Results
ECは、ほとんどの成人組織11の総細胞集団のわずかな割合を表しています。これは、完全に細胞外マトリックス（ECM）および結合組織からECの最大放出を確実にする単一細胞懸濁液中に採取した組織を消化することが重要です。我々の経験では、CD31媒介免疫磁気選択は、濃縮されただけではなく、純粋なEC画分を提供します。従って、別の重要なステップは、クローニングリング（ <st…
Discussion
これにより、純粋な一次TEC培養、例えば、ヒト臍帯静脈EC（HUVEC）13として市販されているEC線や主要EC を用いたin vitro の研究で多くの代替TECを得ることが困難に。しかし、正常組織からこれらのEC集団は、それらの正常な対応物とは著しく異なるTECのためのプロキシとして機能することができます。例えば、TEC は 、生体内で表現型および機能的異常である?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
| Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
| Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
| FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
| 75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
| Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
| Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
| Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
| Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
| Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
| Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
| PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
| RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
| Sterile water | – | – | |
| Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
| 10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
| 15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
| 6-well tissue culture plates | Corning | – | |
| Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
| Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
| Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
| Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
| Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
| Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
| FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
| Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
| Fine-tip marker | – | – | |
| Hemocytometer | – | – | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
| Tissue culture hood | – | – | |
| Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
| Liquid nitrogen freezer | – | – | |
| Microplate or rotary shaker | – | – | |
| Phase contrast light microscope | – | – |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (104), e53072, doi:10.3791/53072 (2015).