We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.
Taze izole edilmiş tümör spesifik endotel hücreleri (TEC), tümör anjiyogenez moleküler mekanizmaları araştırmak ve kanseri için yeni anjiyojenez inhibitörleri geliştirmek için bir in vitro model olarak hizmet etmek için de kullanılabilir. Ancak, fare endotel hücreleri (EC) di vitro genişleme uzun vadeli sebebiyle dışı AT ile fenotipik kültüründe sürüklenme (endotel-to-mezenkimal geçiş) ve kontaminasyona zordur. Bu hali hazırda kültür eş saflaştınldı fibroblast veya tümör hücreleri tarafından outcompeted edilir TEC için de geçerlidir. Burada, koloni seçimi ve in vitro genişleme birleştiğinde immünomanyetik zenginleşme yararlanır yüksek sadakat izolasyon yöntemi tarif edilmektedir. Bu yaklaşım stromal veya tümör hücrelerini kontamine tamamen ücretsizdir saf AK kesirler oluşturur. Aynı zamanda, bu soy takip Cdh5 CRE gösterilmiştir: protokolü ile birlikte kullanıldığında ZsGreen l / s / l raportör fareler, burada tarif edilen, hücrenin kontrol etmek için bir değerli bir araçtırBu farelerden izole AK koloniler olarak saflık kültüründe dayanıklı ve parlak ZsGreen floresan göstermektedir.
Endotel hücreleri (EC), katı tümörlerin gelişimi sırasında gereklidir. Yaygınlaştırılması ve uzak bölgelerde metastaz tohumlama uykuda tümörlerde anjiyojenik anahtarın başlangıcından itibaren, AK tümör büyümesini 1. sürdürmek için kan, oksijen sağlayan kanallar ve besin oluştururlar. Son zamanlarda önerildiği gibi, AK perfüzyon bağımsız fonksiyonlara sahip ve kanser kök hücreleri ve diğer tümör stromal hücrelerinin 2-5 gelişimini destekler bir niş oluşturmaktadır. Böylece, son derece tümör spesifik in vitro kültür EC (TEC) tümör anjiyogenez ve tümör hücreleri ile çapraz konuşma aracılık eden yeni moleküler mekanizmaları ışık tutacak rutin fonksiyonel çalışmalar için izin verir saflaştırılmış.
AK kökenli 6 dokuya bağlı olarak son derece uzmanlaşmış. Farklı olması nedeniyle tümör tiplerinin heterojen ve tümör mikro ortama, TEC, aynı zamanda, bir tümör spesifik uzmanlık o yansıtan benzersiz özellikler gösterebilirdamarsal f. Örneğin, farklı tip veya tümörlerin 7,8 sınıflarda izole TEC gen ifade imzaları çarpıcı farklılıklar bulunmaktadır. Bununla birlikte, TEC olmayan EC, özellikle de tümör bağlantılı fibroblastlar ve tümör hücreleri, sık sık birlikte saflaştırma genom çapında sentezleme analiz karıştırabilir. Bu istenmeyen hücre tipleri TEC kültürlerinin in vitro genişlemesi uzun vadeli dayanan çalışmalarında, özellikle sorunludur.
Burada anlatılan sürekli tümörler ve diğer dokulardan saf AK kültürleri üreten bir yüksek sadakat yöntemidir. AK kesirler ve ko-saflaştırılmış non-EC çıkarılması immünomanyetik kolon zenginleştirme ardından, ilave bir klonlama halka adımı 9 kullanılan saf AK koloniler yakalamak için. Her koloni olmayan EC kirlenmesine neden ortaya çıkması olmadan birden geçişleri için kültürde genişletilebilir. Bu yöntem aynı zamanda endo çalışmaları için ideal olan tek bir izolasyon prosedürü, birden fazla AK klonlar verirendotel heterojenlik. ZsGreen l / s / l muhabiri fareler kültür 10 ZsGreen floresan korumak "kader-eşleştirilmiş" ve silinmez işaretli AK üretmek için değerli bir araçtır: Ayrıca, Cdh5 CRE gösterilmiştir. Protokol küçük ayarlamalar ile, bu yöntem, farklı tümör tiplerinin veya normal dokulara uyarlanabilir olmalıdır.
Nedeniyle olarak saf birincil TEC kültürleri, insan göbek damar EC (HUVEC), 13 gibi ticari olarak temin AT hatları veya primer EC ile in vitro çalışmalar, birçok ikame TEC elde zorluklar. Ancak, normal dokulardan bu AK popülasyonları sadece normal benzerlerinden belirgin farklılık TEC için bir vekil olarak hizmet edebilir. Örneğin, TEC in vivo fenotipik ve fonksiyonel anormal ve bu anormalliklerin bazıları, in vitro 14-18 yılında iletilebilir o…
The authors have nothing to disclose.
ACD is supported by a grant from the National Institute of Health (R01-CA177875). LX is a fellow in the HHMI-funded translational medicine program at UNC Chapel Hill. JVM is supported by a T32 pre-doctoral fellowship from the Integrative Vascular Biology Program at UNC Chapel Hill. We thank Clayton Davis for assistance with confocal microscopy.
Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium (1 g/L D-glucose) (LG-DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
EGM-2 Bullet Kit | Lonza | CC4176 | Not all components used |
Fetal bovine serum (Hyclone) | Thermo Scientific | SH30071.03 | Heat inactivated at 56°C for 30 min |
Nu-Serum IV | Corning | CB-51004 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBBS) | Gibco | 14175-095 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | |
FACS buffer | – | – | 0.5 % BSA and 2 mM EDTA in PBS, filtered through a 0.22 μm filter |
75% v/v ethanol for disinfection | – | – | |
Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotech | 130-048-801 | |
Bovine serum albumin (BSA) fraction V, 7.5% | Gibco | 15260-37 | |
Cell freezing media (Bambanker) | Wako Chemicals | 302-14681 | |
Collagenase type II | Worthington Biochemical | LS004176 | Make stock concentration 2 mg/ml in HBSS |
Deoxyribonuclease I (DNase) | Worthington Biochemical | LS002004 | Make stock concentration 1 mg/mL in PBS |
Dil-Ac-LDL | Biomedical Technologies | BT-902 | |
EDTA, 0.5M, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CL | |
Enzymatic cell detachment solution (Accutase) | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | |
Gelatin, 2 % in water, tissue culture grade | Sigma-Aldrich | G1393-100ML | Dilute in PBS to make 0.5 % gelatin solution |
Mouse FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotech | 130-092-575 | |
Neutral protease (Dispase) | Worthington Biochemical | LS02104 | Make stock concentration 2.5 U/mL in HBSS |
PE-rat anti-mouse CD31 antibody | BD Pharmingen | 553373 | |
RBC lysis buffer (BD Pharm Lyse) | BD Pharmingen | 555899 | |
Sterile water | – | – | |
Trypan blue, 0.4 % | Life Technologies | 15250-061 | |
10 mm tissue culture dishes | Corning | – | |
15 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
50 mL conical tubes (sterile) | Corning | – | |
6-well tissue culture plates | Corning | – | |
Tissue-dissociator tubes (gentleMACS) C tubes) | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
Cell Separator (MidiMACS) | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
Cell strainer 100 μm | Corning | 352360 | |
Cloning rings (assorted sizes) | Bel-Art Products | 378470000 | |
Cryotubes | Thermo Scientific | – | |
Dissecting board | – | – | Sterilize or disinfect with 75% v/v ethanol before use |
Dissecting forceps and scissors | – | – | Sterilize before use |
Dissecting pins 2" | – | – | Sterilize before use |
FACS tubes with 35 μm filter cap | Corning | 352235 | |
Filter cup (Stericup, 0.22 μm) | Millipore | SCGPU05RE | |
Fine-tip marker | – | – | |
Hemocytometer | – | – | |
LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
Magnetic Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Or a centrifuge with similar capacity for 15 mL and 50 mL conical tube centrifugation |
Tissue culture hood | – | – | |
Tissue dissociator (gentleMACS) | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Preset program "m_impTumor_01" used for tissue dissociation |
Liquid nitrogen freezer | – | – | |
Microplate or rotary shaker | – | – | |
Phase contrast light microscope | – | – |