3D Hydrogel Ponteggi per articolare condrociti, Cultura e Cartilagine Generation

Summary

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

Abstract

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Introduction

With its limited self-repair potential, human articular cartilage undergoes frequent irreversible damages. Extensive efforts are currently focused on the development of efficient cell-based approaches for treatment of articular cartilage injuries. The success of these cell-based therapies is highly dependent on the selection of an optimal cell source and the maintenance of its regenerative potential. Chondrocytes are a common cell source for cartilage repair, but they are limited in supply and can de-differentiate during in vitro expansion in 2D monolayer culture thereby limiting their generation of hyaline cartilage ¹.

The aim of this protocol is to establish a 3-dimensional hydrogel platform for an in vitro comparative study of human chondrocytes from different ages and disease state. Unlike conventional two-dimensional (2D) culture, three-dimensional (3D) hydrogels allow chondrocytes to maintain their morphology and phenotype and provides a physiologically relevant environment enabling chondrocytes to produce cartilage tissue ^2,3. In addition to providing a 3D physical structure for chondrocyte culture, hydrogels mimic the function of native cartilage extracellular matrix (ECM). Specifically, the inclusion of chondroitin sulfate methacrylate provides a potential reservoir for secreted paracrine factors ⁴ and enables cell-mediated degradation and matrix turnover ⁵. Although many 3D hydrogel culture systems have been utilized widely in various studies including agarose and alginate gels, we have used a biomimetic 3D culture system that has some distinct advantages for chondrocyte culture. Chondroitin sulfate (CS) is an abundant component in articular cartilage and the PEG-CS hydrogels have been shown to maintain and even enhance chondrogenic phenotype and facilitate cell-mediated matrix degradation and turnover ^2,5. In addition, the mechanical properties of the hydrogel scaffold can be easily modulated by changing concentration of PEG and hence can be utilized to further enhance the regeneration potential of chondrocytes or a related cell type ^6,7. PEG/CSMA is also biocompatible and hence has the potential for a direct clinical application in cartilage defects for example. The limitation for this system is its complexity and the use of photopolymerization that can potentially affect cell viability as compared to simpler systems like agarose, however the advantages for the chondrocyte culture outweigh the potential limitations.

The 3D hydrogel culture is compatible with conventional assay for evaluation of cell phenotype (gene expression, protein immunostaining) and functional outcome (quantification of cartilage matrix production, mechanical testing). This favorable 3D environment was tested to compare the tissue regeneration potential of human chondrocytes from three different aged populations in long-term 3D cultures.

The outcomes were evaluated via both phenotypic and functional assays. Juvenile, adult and OA chondrocytes showed differential responses in the 3D biomimetic hydrogel culture. After 3 and 6 weeks, chondrogenic gene expression was upregulated in juvenile and adult chondrocytes but was downregulated in OA chondrocytes. Deposition of cartilage tissue components including aggrecan, type II collagen, and glycosaminoglycan (GAG) was high for juvenile and adult chondrocytes but not for OA chondrocytes. The compressive moduli of the resulting cartilage constructs also exhibited similar trends. In conclusion, both juvenile and adult chondrocytes exhibited chondrogenic and cartilage matrix disposition up to 6 weeks of 3D culture in hydrogels. In contrast, osteoarthritic chondrocytes revealed a loss of cartilage phenotype and minimal ability to generate robust cartilage.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida dei soggetti Stanford University Umani e approvati protocollo Institutional Review Board. Isolamento 1. articolare di condrociti Ottenere la cartilagine da tessuti scartati durante protesi totale di ginocchio e sezionare come descritto in precedenza 8. Visivamente selezionare i condili femorali mediale o laterale di campioni di cartilagine per superfici lisce e rendere incisione alla superficie della cartilagine attraverso un bisturi per rimuovere 4-5 biopsie mm cartilagine senza influenzare l'osso subcondrale. Isolare condrociti dalla matrice extracellulare per dissociazione enzimatica del tessuto con il trattamento / N O con collagenasi purificata. Utilizzare rapporto 1: 1 di collagenasi II (125 U / ml) e Collagenasi IV (160 U / ml) in terreni di coltura di condrociti a 37 ° C. Il giorno seguente, filtrare il tessuto digerito contenente le cellule dissociate attraverso un 70mm pori maglie di dimensione nylon. Lavare due volte con 20 ml di DMEM / F12 e centrifugare a 600 xg per 5 min. Piastra le condrociti isolati ad una densità di 1 x 10 6 cellule / 60 mm piatto di coltura dopo risospensione in DMEM / F12 addizionato con 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 25 mg / ascorbato ml, 2 mM L-glutammina, antimicrobici (100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, e 0,25 mg / ml Fungizone). Conservare le piastre a 37 ° C e mantenere le colture di condrociti primari come un monostrato alta densità prima incapsulamento in idrogel biomimetici. 2. Biomimetic Hydrogel Fabrication NOTA: Questo metodo permette la sintesi di un idrogel biomimetico contenente poli (etilene glicol diacrilato) (PEGDA, MW 5000 g / mole), condroitin solfato-metacrilato (CS-MA) in DPBS. L'aggiunta di fotoiniziatore permette reticolazione fotoattivato. La composizione idrogel finale contiene il 7% pesaret / Volume (w / v) di PEGDA, 3% w / v di CS-MA, e 0,05% w / v di fotoiniziatore. Sintetizzare CS-MA per funzionalizzazione CS polimero con gruppi di metacrilato. Preparare la soluzione tampone di 50 mM di acido 2-morpholinoethanesulfonic (MES) e 0,5 M di cloruro di sodio (NaCl) sciogliendo 1,952 g di MES e 5,84 g di NaCl in 200 ml di acqua deionizzata (DIH 2 O). Sciogliere 5 g di sale di condroitin solfato sodico nella soluzione tamponata. Aggiungere 0,532 g (4,62 mmol) N-idrossisuccinimmide (NHS) e 1.771 g (9.24 mmol) 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) cloridrato -carbodiimide (EDC) (rapporto molare di NHS: EDC = 1: 2) a la soluzione e mescolare per 5 min. Aggiungere 0,765 g (4,62 mmol) metacrilato di 2-amminoetil (Aema) (rapporto molare di NHS: EDC: Aema = 1: 2: 1) alla soluzione e mantenere la reazione a temperatura ambiente per 24 ore. Purificare il composto con la dialisi contro acqua deionizzata (diH 2 O) per 4 giorni usando tubo di dialisi (12-14 kDa MWCO). Filtrare la purified soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron e posizionare i tubi aperti contenenti la soluzione in un essiccatore sotto vuoto e O / N. Assicurarsi che tutti i tubi siano protetti dalla luce. Conservare il polimero sciolto a -20 ° C al riparo dalla luce e dall'umidità. Incapsulamento 3. cellulare Autoclave i film e cilindrici aste PCR (per punzonatura gli idrogel 3D cell-carico) e sterilizzare lo stampo gel cilindrica su misura per immersione in 0,2 micron filtrato etanolo al 70% in cappuccio coltura tissutale sotto raggi UV. Sigillare il fondo dello stampo gel con pellicola PCR autoclave senza bolle d'aria o lacune per impedire perdite. Tenerlo in una piastra sterile, 150 millimetri. Il giorno prima di incapsulamento delle cellule in idrogel biomimetica, dissociare il condrociti monostrato ad alta densità con trattamento O / N in Collagenase II e soluzione Collagenasi IV. Utilizzare 125 U / ml per Collagenasi II e 160 U / ml per Collagenasi VI ciascuno in crescita di condrociti dei mediaa 37 ° C. Dai tubo da 50 ml e si aggiungono 5% peso / volume (w / v) di poli (etilene glicol diacrilato) (PEGDA, MW = 5,000 g / mole), 3% w / v condroitin solfato-metacrilato (CS-MA), e 0.05% w / v fotoiniziatore in DPBS. Agitare la provetta per miscelare la soluzione e tenerlo da parte. Proteggere il tubo dalla luce. Raccogliere le cellule dissociate in un tubo Falcon da 50 ml, contare e centrifugare a 460 xg per 5 min. Aspirare tutti i media dal tubo cellule e aggiungere il materiale sopra il gel miscelato risospendere le cellule ad una densità di 15 × 10 6 cellule / ml. Mescolare 30 volte a fondo, evitando la formazione di bolle d'aria. Dispensare 72 ml di sospensione cellulare-idrogel o da soli idrogel nello stampo gel cilindrica su misura e indurre gelificazione attraverso l'esposizione alla luce UV (365 nm) a 3 mW / m 2 per 5 min. Preparare una soluzione idrogel senza contenuto della cella. Utilizzare questi costrutti come controlli negativi per il futuro i test biochimici e meccanici. Misure l'intensità della luce UV con un misuratore di intensità UV. Per regolare l'intensità, modificare la distanza tra la sorgente di luce UV e il ponteggio idrogel durante la gelificazione. NOTA: Dal momento che l'idrogel contiene CS, il contributo acellulare viene sottratto dal contenuto GAG biochimica degli idrogel cellulari carichi di rappresentare solo il GAG cellulare. Utilizzare un bisturi per tagliare il film per easy peel e rimuovere con cautela. Con l'aiuto delle aste cilindriche, spingere fuori il gel in una piastra ben 6 con 5 ml di DPBS sterili per lavare gel polimerizzato e cellule allentati. Culture idrogel cellulari carichi in piastre da 24 pozzetti contenenti 1,5 ml di terreni di crescita di condrociti in ogni pozzetto. Utilizzare una spatola monouso per trasferire i idrogel lavati nel pozzo. Valutare la vitalità cellulare del morto in diretta colorazione 24 ore post-incapsulamento utilizzando un kit di sopravvivenza / citotossicità. Cultura idrogel cellulari carichi e gli idrogeli vuote per 3-6 settimane che cambiano a gro chondrocyte freschiwth dei media ogni 2 giorni prima della raccolta per le analisi. 4. RNA Estrazione e Gene Expression analisi Aspirare accuratamente la memoria e poi PBS sterile 1X sulla cellula-carico nonché gli idrogeli controllo vuote. Con l'aiuto di una spatola sterile, trasferire ogni idrogel di clean 1,5 ml provetta Eppendorf e aggiungere 250 ml di Tri-reattivo ad ogni provetta. Seguire le istruzioni del produttore per isolare l'RNA. Dopo l'isolamento di RNA e quantificazione uso 1 mg di esso da ogni campione e di eseguire una trascrizione inversa in cDNA utilizzando l'alta capacità cDNA corredo d'inversione di trascrizione. Per PCR quantitativa utilizzare TaqMan array di espressione genica per l'esame dell'espressione di geni di interesse. Normalizzare i livelli di espressione genica internamente per GAPDH. Per le condizioni di PCR includere un 2 min di incubazione a 50 ° C per inattivare ampliconi precedenti con glicosilasi uracile-DNA, seguito da 1060; min di incubazione a 95 ° C per attivare la polimerasi Taq. Quindi eseguire cicli di PCR quaranta, costituito da 15 sec a 95 ° C, e 1 minuto a 60 ° C. 5. Analisi biochimiche Per ogni costruzioni cellulari-idrogel quantificare il DNA e glicosaminoglicani solfato (sGAG) la produzione come segue. Aspirare accuratamente la memoria e poi PBS sterile 1X sulla cellula-carico nonché gli idrogeli controllo vuote. Pesare un tubo vuoto e mettere l'idrogel all'interno dopo assorbente su carta velina e registrare il peso o il peso umido degli idrogel. Congelare ogni idrogel a -20 ° C in un tubo separato ml eppendorf 1.5 per digestione enzimatica e successivamente utilizzare una aliquota di prodotto digerita eseguire PicoGreen dosaggio (DNA) e dimetil-metilene assay blu (GAG). Preparare la soluzione papainase per digestione enzimatica degli idrogel. Per prima cosa preparate il buffer PBE pesando 7,1 g di sodio phosphate bibasico (Na 2 HPO 4) e 1,6 g di acido etilendiamminotetracetico disodico sale (EDTA-Na 2). Sciogliere in 500 ml di dH 2 O, regolare il pH a 6,5 e filtrare la soluzione purificata attraverso un filtro 0.22 mm. Sciogliere 0,035 g di L-cisteina in 20 ml di tampone PBE. Filtrare la soluzione e 100 ml di sterile papaina enzima. Al momento di eseguire saggi, prendere le provette da -20 ° C e aggiungere 300 microlitri della soluzione papaina pronto a idrogel congelati. Schiacciare il gel con un mortaio e pestello e mescolare bene con il pestello motore. Portare il volume a 500 ml con soluzione papaina aggiuntivo. Eseguire la stessa procedura per i gel di controllo. Incubare a 60 ° C per 16 ore 3,9. La soluzione contenente l'idrogel digerito può quindi utilizzato per il DNA e GAG ​​quantificazione. Misurare il contenuto di DNA con il saggio PicoGreen con Lambda fago DNA di serie seguente pr del produttoreotocol. Quantificare il contenuto solfato-GAG utilizzando il blu 1,9-metilmetilene (DMMB)-dye legame test con squalo condroitin solfato di serie 10. Determinare il contenuto di GAG dividendo l'importo di GAG per la corrispondente peso umido. 6. Prove meccaniche Eseguire prove di compressione non confinati usando un sistema di prova Instron 5944 dotato di una cella di carico di 10 N. Dopo i giorni desiderati di coltura in vitro, eseguire il test di compressione sull'impalcatura cellula-idrogel e gli idrogeli controllo acellulari. Immergere i campioni in un bagno PBS a temperatura ambiente e comprimere ad un tasso del 1% ceppo / sec per un ceppo massimo del 15% 11,12 dal momento che la sforzo fisico vissuta da tessuto cartilagineo sotto condizioni di carico è stato segnalato per essere 10-20% 13,14. Creare lo stress contro curve deformazione e la curva in forma con un terzo ordine un'equazione polinomiale. Determinare i compressive tangente modulo dalla curva equazione forma in valori di deformazione del 15%.

Representative Results

Idrogel bioattivi contenenti PEG e frazioni CS (Figura 1) rappresentano una piattaforma ideale per la cultura e la maturazione dei condrociti articolari umani 2,3,5,7. I condrociti di diverse epoche e stati patologici possono essere coltivati ​​con il metodo descritto ed analizzati per la loro fenotipo, espressione genica e proprietà biochimiche e meccaniche del tessuto cartilagineo generato. Tre campioni chondrocyte, juvenile- 6 mesi, adulto-34 anni e osteoarthritic- 74 anni, sono state raccolte dopo 3 settimane di coltura in 3D idrogel biomimetici. Analisi dell'espressione genica di condrociti normali, sia giovani che adulti, hanno mostrato un aumento dell'espressione dei geni COL2A1 e COL6A1 condrociti. Al contrario, condrociti malate mostrato una diminuzione drammatica COL2A1 mantenendo l'espressione di Col6a1 (Figura 2) mostra una perdita di fenotipo condrogenica pur essendo coltivate in un ambiente biomimetico favorevole. Gli idrogel CS-PEG servono anche come un ambiente dinamico per i condrociti a proliferare, digerire la matrice preesistente di PEG e CS e depositano la loro matrice pericellulare e extracellulare, i principali componenti del tessuto cartilagineo maturo. Alla luce di queste capacità, espansione di condrociti dopo 3 settimane di coltura in vitro può essere stimato per la quantificazione del DNA con il colorante PicoGreen. Analisi comparativa dei tre gruppi di cellule mostrano che la densità cellulare di giovani e adulti popolazioni è rimasto invariato mentre condrociti OA hanno mostrato una diminuzione drammatica rispetto al giorno 1 di cultura. Stata anche osservata una perdita del contenuto di DNA per OA ma non altre condrociti suggerendo possibile morte delle cellule durante la coltura a lungo termine (Figura 3). La matrice secreta è stato quantificato come contenuto solfato-GAG per DMMB test-dye vincolante nella fase punto finale dopo 3 settimane di culture. Contenuto GAG è normalizzata per il peso umido del idrogel come recorded prima della digestione enzimatica e il contributo acellulare viene sottratto. Come mostrato in figura 4, condrociti depositato un'analoga quantità significativa di GAG per 3 settimane di coltura in idrogel 3D. La presenza di un ponteggio fisica consente la valutazione delle proprietà biomeccaniche dei campioni attraverso unconfined prove di compressione 2,3. Mentre idrogel acellulari subiscono una diminuzione della moduli compressione, costrutti cellulari carichi mantenuti i moduli di compressione dopo 3 settimane in coltura (Figura 4). Il fenotipica, analisi biochimiche e biomeccaniche qui descritte sono quindi utili per valutare e comprendere le potenzialità di diverse popolazioni di condrociti per l'ingegneria cartilagine. Figura 1. PEG-CS idrogel biomimetici per 3D condrociti cultura. condrociti sono risospesi in una miscela contenente poli (glicole etilenico diacrilato) (PEGDA) e condroitin solfato-metacrilato (CS-MA) e colato nello stampo gel cilindrica su misura. Dopo l'esposizione ai raggi UV, solidificati gel sono raccolti dagli stampi e vitalità cellulare è valutata mediante colorazione morto dal vivo 24 ore post-incapsulamento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Espressione dei geni condrogeniche in condrociti umani coltivati ​​in 3D idrogel biomimetici. Espressione genica quantitativa di marker cartilagine COL2A1 e Col6a1 da giovani, adulti e OA condrociti dopo 3 settimane di coltura in 3D idrogel biomimetici. I valori sono normalizzati a livello di espressione genica a giorno 1. Errore bars rappresentano media ± SD. * p <0,05 come determinato da un test t Student a due code. Modificato da Smeriglio e coll. 2 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. contenuto di DNA in condrociti umani coltivati ​​in idrogel biomimetici 3D. Quantificazione del DNA da PicoGreen test in giovani, adulti e OA condrociti dopo 3 settimane di coltura in 3D idrogel biomimetici. I valori sono normalizzati a livello del DNA a giorno 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <br /> Figura 4. Misurazione del contenuto di GAG e test di compressione non confinato di condrociti umani in giorno 1 e dopo 3 settimane di cultura in 3D idrogel biomimetici. (A) GAG quantificazione mediante test DMMB in condrociti al giorno 1 e dopo 3 settimane di cultura idrogel biomimetici 3D. I valori sono normalizzati a bagnare peso (ww) ed espressi in mg / g. (B) modulo di compressione (kPa) di acellulari e cellulari carichi di idrogel a giorno 1 e dopo 3 settimane di cultura in 3D idrogel biomimetici. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Come riportato in questo protocollo, gli idrogel 3D sono in grado di mantenere condrociti fenotipo nella cultura, evitando il processo di de-differenziazione delle cellule in cellule fibrocartilagine riscontrate in genere con colture monostrato ^15. Inoltre, le colture a lungo termine di idrogel costrutto chondrocytes- rivelato un ambiente favorevole che mantiene le caratteristiche intrinseche delle cellule associate con l'età e la malattia.

L'uso di un idrogel biomimetico 3D ha diversi vantaggi. In primo luogo, l'inclusione di condroitin solfato (CS), uno dei principali componenti trovati nella cartilagine articolare, attivare le cellule di degradare la matrice idrogel secernendo condroitinasi e stabilire la cartilagine nuova sintesi extracellulare matrice ^{5, 16.} Inoltre, CS è stato dimostrato per avere proprietà anti-infiammatorie nel giunto artritico. L'idrogel biomimetico può anche essere usato come materiale per la consegna ponteggio cella riparazione della cartilagine, e può essere modificato chimicamenteper facilitare una migliore integrazione dei tessuti ^{17,18-biomateriale.}

L'uso degli idrogel PEG-CS consente colture a lungo termine di condrociti e la valutazione delle proprietà biochimiche e meccaniche. Qui mostriamo come questa piattaforma può essere utile per le analisi comparative delle varie fonti di condrociti differenziati al fine di definire il tipo cellulare ottimale per l'ingegneria cartilagine. È interessante notare che, condrociti incapsulate in idrogel rimangono vitali e proliferano in base alle loro capacità intrinseche. I supporti composizione idrogel, infatti, la crescita di giovani e adulti condrociti sani come mostrato in Figura 2. La composizione e la struttura degli idrogel descritti promuove anche la formazione di tessuto cartilagineo come indicato dalla deposizione di matrice extracellulare funzionale valutata glicosaminoglicani (GAG ) quantificazione.

Un ulteriore vantaggio è che i costrutti chondrocyte-idrogelpuò essere valutata per le proprietà meccaniche del tessuto cartilagineo neoformato. Si noti che il test di compressione non confinato dovrebbe essere eseguita sul idrogel acellulare per il confronto. Gli idrogeli, infatti, hanno una rigidità intrinseca dovuta alla rigidità delle porzioni CS. Ceppo compressione unconfined del 5-20% (a velocità di deformazione 1% / s) può essere applicato per la prove meccaniche della cartilagine tessuto ^11,12 in quanto il ceppo fisiologico sperimentato da tessuto cartilagineo sotto condizioni di carico è stato segnalato per essere 10-20 ^13,14%. La risposta delle cellule sia carichi e acellulari idrogel a prove meccaniche è stata valutata al punto finale cultura. Nell'esempio descritto sopra osservato una rigidità paragonabile dei costrutti contenenti adulti e giovanili condrociti in contrasto con la rigidità inferiore dei costrutti contenenti condrociti OA. Tali proprietà meccaniche del costrutto cellule idrogel permettono la valutazione delle proprietà funzionali deltessuto formata dando una analisi approfondita della capacità maturazione delle cellule.

In conclusione, l'utilizzo degli idrogel biomimetici 3D per studiare il potenziale della popolazione condrociti diverso per generare tessuto cartilagineo può essere ampiamente applicato. Oltre agli studi in vitro qui descritti, trapianto in vivo dei costrutti cellulari carichi può essere prevista per studiare la maturazione delle cellule e potenziale rigenerativo nel contesto fisiologico. Ulteriori modifiche della piattaforma idrogel con ulteriori fattori biomimetici possono anche essere immaginato per ottimizzare la proliferazione di condrociti e maturazione.

Materials

juvenile chondrocytes (Clonetics™ Normal Human Chondrocyte Cell System )	Lonza	CC-2550
adult chondrocytes (Clonetics™ Normal Human Chondrocyte Cell System)	Lonza	CC-2550
poly(ethylene glycol diacrylate)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-1000-1g
2-morpholinoethanesulfonic acid	Sigma	M5287
photoinitiator	Irgacure	2959
sodium chloride	Sigma	S9888
chondroitin sulfate sodium salt	Sigma	C9819
N-hydroxysuccinimide	Sigma	130672
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride	Sigma	E1769
2-aminoethyl methacrylate	Sigma	516155
dialysis tubing	Spectrum Laboratories	132700
Collagenase 2	Worthington Biochemical	LS004177
Collagenase 4	Worthington Biochemical	LS004189
DMEM/F12 media	HyClone, Thermo Scientific	SH3002301
live/dead assay	Life Technologies	L3224
Tri reagent	Life Technologies	AM9738
Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit	Invitrogen	P11496
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S3264
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt	Sigma	E5134
L-Cysteine	Sigma	C1276
1,9-dimethylmethylene blue	Sigma	341088
Instruments
UV light equipment – XX-15LW Bench Lamp, 365nm	UVP	95-0042-07
Instron 5944 testing system	Instron Corporation	E5940