miRNA expressie analyses bij prostaatkanker Klinische Tissues
Summary
Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).
Abstract
Een cruciale uitdaging bij prostaatkanker (PCA) klinische behandeling wordt gesteld door de ontoereikendheid van de momenteel gebruikte biomarkers voor de ziekte van screening, diagnose, prognose en behandeling. De laatste jaren microRNA (miRNAs) zijn gebleken veelbelovende alternatieve biomarkers voor prostaatkanker diagnose en prognose. De ontwikkeling van miRNAs zo effectief biomarkers voor prostaatkanker sterk afhankelijk van de nauwkeurige detectie in klinische weefsels. miRNA analyses in prostaatkanker klinische monsters is vaak een uitdaging vanwege tumor heterogeniteit, steekproeffouten, stromale vervuiling etc. Het doel van dit artikel is om een vereenvoudigde workflow beschrijven miRNA analyses in gearchiveerde FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische monsters met een combinatie van kwantitatieve real-time PCR (RT-PCR) en in situ hybridisatie (ISH). Binnen deze workflow optimaliseren we de bestaande methodieken voor miRNA extractie uit FFPE en bevroren prostaat tissues en expressie geanalyseerd door Taqman-probe gebaseerde miRNA RT-PCR. Verder beschrijven we een geoptimaliseerde werkwijze voor ISH analyse formiRNA detectie in prostaatweefsel met behulp vergrendeld nucleïnezuur (LNA) – probes. De geoptimaliseerde miRNA ISH protocol kan worden toegepast op prostaatkanker weefselobjectglaasjes of prostaatkanker weefsel microarrays (TMA).
Introduction
Kanker van de prostaat is een algemeen diagnose mannelijke maligniteit dat is een van de belangrijkste oorzaken van kanker-gerelateerde sterfte bij mannen. In de VS zijn naar schatting 220.800 nieuwe gevallen en 27.540 sterfgevallen zal worden gerapporteerd in 2015 1.
Prostaatkanker is een heterogene ziekte met zeer variabele ziekte natuurlijk- tumoren kunnen indolente of zeer agressief zijn. Een cruciale uitdaging bij prostaatkanker klinische behandeling wordt gesteld door de ontoereikendheid van de momenteel gebruikte methoden / biomerkers voor de ziekte van screening, diagnose, prognose en behandeling 2. Huidige screeningswerkwijzen omvatten prostaatspecifiek antigeen (PSA) test en een digitaal rectaal onderzoek (DRE) gevolgd door prostaatbiopsieën 3. Prostaatspecifiek antigeen (PSA) de meest gebruikte prostaatkanker biomarker die aanzienlijk revolutie klinische behandeling en verbeterde overlevingskansen 4. Vanwege inherente beperkingen van PSA waaronder lack specificiteit, PSA-screening heeft geleid tot meer diagnose en op behandeling van de ziekte. Gelet hierop, zijn intensieve inspanningen gericht op het zoeken naar alternatieve prostaatkanker biomarkers, met name die welke de agressiviteit van de ziekte kunnen voorspellen en betere beslissingen te nemen behandeling 4,5. In de afgelopen jaren, microRNAs (miRNAs) zijn ontstaan als veelbelovende alternatieve prostaatkanker biomarkers.
MicroRNAs (miRNAs) vormen een evolutionair geconserveerde klasse van kleine niet-coderende RNA's die genexpressie onderdrukken post-transcriptie via sequentie-specifieke interacties met de 3'-onvertaalde gebieden (UTR) van verwante mRNA targets. Geschat wordt dat> 60% van mRNA's zijn geconserveerd doelwit van miRNAs 6. miRNA genen in intergene gebieden of binnen introns en exons eiwit / niet-eiwit coderende genen 7. Deze genen worden preferentieel getranscribeerd door RNA polymerase II in primary miRNAs (pri-miRNAs, diverse kilobasen lang) die vorm haarspeld vormige stam lus secundaire structuren. Deze pri-miRNAs worden verwerkt tot voorloper miRNAs (pre-miRNAs, 60-75 nucleotiden lang) die worden geëxporteerd naar het cytoplasma en verder verwerkt tot mature miRNAs (18-25 nucleotiden lang) 8-10. miRNAs regelen belangrijke cellulaire processen waaronder proliferatie, ontwikkeling, differentiatie en apoptose 11. Studies suggereren een wijdverspreide ontregeling van miRNA expressie profielen in verschillende menselijke maligniteiten waaronder prostaatkanker 12-15. miRNA expressie profielen zijn gemeld op grote schaal worden dysregulated in primaire en uitgezaaide prostaatkanker. Veranderde miRNA expressie in verband gebracht met prostaatkanker progressie, agressiviteit en herhaling gewezen op de prognostische mogelijkheden van miRNAs 12,14,16-19. Een groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal blijkt dat miRNAs spelen een belangrijke mechanistische rol bij prostaatkanker initiatie, ontwikkeling, vooruitgangion en metastase. Overall, miRNAs zijn in opkomst als veelbelovende alternatieve biomarkers voor prostaatkanker diagnose en prognose die onderscheid kunnen maken tussen normale en kanker weefsels en hulp in gelaagdheid van prostaattumoren 12. Ook miRNAs zijn belangrijke doelen voor de ontwikkeling van effectieve therapieën tegen prostaatkanker 20.
Vanwege hun kleine omvang en de weerstand tegen endogene RNase activiteit miRNAs stabiel biomarkers die gemakkelijk kan worden gedetecteerd in formaline gefixeerde weefsels 21 en prostaatbiopsieën 22. Bovendien hebben de expressie profielen van miRNAs vergeleken in bevroren en in formaline gefixeerde weefsels en zijn gevonden om sterk te zijn gecorreleerd 21. Echter, miRNA expressie profilering bij prostaatkanker klinische weefsels vaak uitdagende vanwege tumor heterogeniteit, steekproeffouten, stromale vervuiling etc. De ontwikkeling van miRNAs zo effectief biomarkers voor prostaatkanker zwaar relies hun nauwkeurige detectie in klinische weefsels. Hier beschrijven we een vereenvoudigde workflow gebruikt in ons lab voor miRNA expressie profilering in gearchiveerde FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische monsters. We gebruiken een combinatie van kwantitatieve real-time PCR en in situ hybridisatie voor miRNA analyses van klinische monsters, met de voormalige waarbij meer kwantitatieve informatie en de laatste voor het visualiseren van de differentiële expressie van miRNA potentiële biomarkers in een reeks van weefsels. Binnen deze workflow optimaliseren we de bestaande methodieken voor miRNA extractie uit FFPE en bevroren prostaat weefsels, expressie geanalyseerd door Taqman-probe gebaseerde miRNA RT-PCR en miRNA in situ hybridisatie techniek met behulp vergrendeld nucleïnezuur (LNA) gebaseerde sondes 23. LNA-probes bieden verhoogde gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met DNA- of RNA probes en maakt robuuste detectie van alle miRNA sequenties, ongeacht hun GC-gehalte en tevens discriminatie toestaantie van miRNA families. De geoptimaliseerde miRNA ISH protocol kan worden toegepast op prostaatkanker weefselobjectglaasjes of prostaatkanker weefsel microarrays (TMA), waarbij de laatste met het vermogen om miRNA biomarkers versnellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel beschrijven we een vereenvoudigde workflow voor miRNA expressie profilering in gearchiveerd FFPE of vers bevroren prostaatkanker klinische weefsels. Bij prostaatkanker, een aantal studies suggereren een belangrijke rol van microRNAs bij prostaatkanker initiatie, progressie en metastase. Echter, vaak tegenstrijdige resultaten verkregen op een specifieke miRNA 22 sinds de miRNA extractie en analyse methoden verschillen sterk. Gezien de opkomende onderzocht van de mogelijke toepassing van miRNAs a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Roger Erickson voor zijn steun en hulp bij de voorbereiding van het manuscript.
Dit werk werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health
(Grant Number RO1CA177984; RO1CA138642), VA programma project over prostaatkanker (BX001604).
Materials
| Microtome | Leica Biosystems | RM2255 | |
| Arcturus Autopix for LCM | Arcturus/ Life Technologies | LCM1621/LCM1110 | Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. |
| CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| miRNeasy FFPE Kit | Qiagen | 217504 | |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4351106 | |
| Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4366596 | |
| Taqman Fast Universal PCR master mix | Applied Biosystems/ Life Technologies | 4352042 | |
| DIG labeled LNA probe for U6 | Exiqon | 99002-01 | |
| BM Purple AP substrate | Roche | 11442074001 | |
| Pre-hybridization solution | Biochain | K2191050-1 | |
| Hybridization solution | Biochain | K2191050-2 | |
| Blocking solution | Biochain | K2191050-8 | |
| AP-conjugated anti-digoxigenin antibody | Biochain | K2191050-7 | |
| Aqueous mounting media | Vector Laboratories | H-5501 | |
| Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent) | Life Technologies | 15596-018 | |
| Harris hematoxylin | Statlab | SL200 | |
| Eosin | Statlab | SL201 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
- Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
- Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
- Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what’s new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
- Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
- Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
- Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
- Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
- Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
- Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
- Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
- Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
- Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
- Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
- Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
- Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
- Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
- Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
- Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2′-Amino- and 2′-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
- Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
- Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
- Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
- Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
- Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).
