使用拉姆齐试验来测量液体分泌和离子流率在<em>果蝇</em>马氏管

Summary

这个协议描述了使用的拉姆齐测定来测量流体分泌率从果蝇孤立马氏（肾）细管。此外，使用离子特异性电极来测量分泌的流体钠和钾的浓度，允许跨上皮离子通量的计算，进行说明。

Abstract

肾小管上皮离子转运的调制允许生物体维持离子和渗透压稳态变化的外部条件的面部。 果蝇马氏（肾）肾小管提供研究上皮细胞离子转运的分子机制，因为这种微生物及其肾小管生理研究的辅助强大的遗传学一个无与伦比的机会。在这里，我们描述了使用的拉姆齐测定来测量流体分泌率从分离的飞肾小管，与使用离子特异性电极测量钠和钾的浓度，在分泌的流体。该测定允许研究的跨上皮流体和离子通量〜20小管的时间，而不需要在分泌的流体传送到一个​​单独的装置来测量离子浓度。遗传上不同的小管可以分析，以评估在运输过程特定基因的作用。另外，将bathing盐水可以被修改来检查添加其化学特性，或药物或激素的作用。综上所述，本技术允许的上皮离子输送这些传输机制中的果蝇细管，以及调控基本机制的分子表征。

Introduction

肾上皮细胞离子转运underlies有机体iono-和渗透压调节。 果蝇马氏（肾）肾小管提供研究上皮细胞离子转运的分子机制提供了无与伦比的机会。这是由于果蝇的强大遗传学，配对的其肾小管生理研究的可访问的组合。拉姆齐检测，谁率先技术¹研究者的名字命名，测量液体分泌率从孤立的马氏管，并建立在果蝇于1994年陶氏和他的同事^2。这种利用果蝇的遗传工具，如GAL4-UAS系统^3,4，确定细胞特异性的信号通路调节液分泌铺平了道路进一步研究。实例包括钙信号响应于肽激素⁵以及很多其他^6,7。

ve_content“>遗传技术和古典生理研究的组合表明，尿代在飞是通过从细管的主要链段的氯化钾富液的分泌。这是通过阳离子的平行跨上皮分泌，主要是^K +也^钠离子，通过主细胞，和Cl ^–通过星状细胞分泌^8-12分别测量跨上皮^K +和Na ⁺通量的能力允许的传输机制比液体分泌的测量更详细的表征孤独。例如，在未刺激的果蝇细管为Na ^{+ / K + -ATP酶}抑制剂哇巴因对分泌液²没有影响，即使当其摄取到主细胞是由有机阴离子转运抑制剂牛磺胆¹³抑制。然而，林顿和奥唐纳发现，哇巴因去极化基底外侧膜电位，并增加了^钠离子通量^9。如图中代表结果，我们重复这些发现，并表明^，K +通量是伴随降低^14;增大^的 Na +通量和降低^的 K +通量对液分泌相反的作用，造成在分泌无净的变化。因此，有两项决议的“乌本苷悖论”，即，哇巴因在果蝇小管的分泌液没有效果初步观察：首先，在刺激小管，哇巴因对液体分泌的效果并不明显，由于其吸收的有机阴离子转运^13;第二，在未受刺激的小管，哇巴因一直反对对跨上皮^Na +和K ^+流的影响，导致液分泌没有净变化（见代表性的成果和参考文献9）。因此， ^钠离子的主要作用/ K ^{+ -ATP}酶在未刺激的小管是降低细胞内Na ^+的浓度 ，以产生有利的浓度梯度为^Na +的偶联的运输过程横跨基底外侧膜。事实上，通过分别测量^Na +和K ⁺通量，我们表明，小管缺乏飞钠-钾-2-氯转运蛋白（NKCC）具有降低的跨上皮^的 K +通量，与哇巴因加入后没有进一步降低，并在经上皮无变化^Na +的^线 14。这些发现支持了我们的结论，即^Na +的进入从而NKCC细胞通过的Na ⁺ / ^K + -ATP酶回收。在另一个例子中，Ianowski 等人观察到，降低浴^的 K +浓度从10mM至6毫从吸血蝽下降跨上皮^K +通量并增加经上皮^Na +的磁通在小管，并在流体分泌没有净变化<sup> 15。横跨幼虫小管上^的 Na +通量和K ^+流的不同作用也已在果蝇小管中观察到响应于不同的盐饮食¹⁶并在两个蚊种响应于饲养盐度^17。

在拉姆齐测定制备跨上皮离子通量的测定的最大挑战是分泌的流体中的离子浓度的测定。这个挑战已经取得了不同的解决方案，其中包括火焰photometery ^18，使用放射性离子¹⁹和电子探针波谱仪^20。这些技术需要分泌的液体滴转移到仪器的离子浓度的测量。因为流体的由未刺激的果蝇细管分泌的体积是小的，典型地〜0.5标升/分钟，这会带来一个技术挑战，也引入了错误，如果一些分泌的流体是在传输丢失。与此相反，使用离子特异性电极允许原位离子活性（从该离子浓度可以计算）的测量。目前的协议改编自所使用的Maddrell和同事使用缬氨霉素作为^第 K +离子载体²¹测量通过吸血肾小管跨上皮^的 K +通量，并且还描述了使用4- 叔 -butylcalix [4]芳烃-四乙酸的四乙酯基^钠离子的特征在于Messerli 等特异性离子特异性电极。人^。22。离子特异性电极也被用于测量离子浓度在流体中的拉姆齐测定在成人^9,23和幼虫¹⁶ 果蝇由马氏管分泌，新西兰阿尔派恩威塔（Hemideina毛利 ^）24和在蚊子^17。

在这里，我们详细描述了使用的拉姆齐作为说来测量流体分泌率在从果蝇马氏管，以及使用离子特异性电极以所分泌的流体中确定^的 K + ^和 Na +的浓度，从而跨上皮离子通量的计算。该试验的概述在图1中提供 。

图1.原理马氏管和拉姆齐分析与使用离子专用电极来测量离子浓度 。这个数字说明了该设置为拉姆齐检测。 （A）中的每个飞有四个小管，一对前管和一对后小管的，即浮在腹腔内通过血淋巴包围。在每一对中，两个小管联接在输尿管，然后在肠和hindgu交界清空尿吨。该管的盲端。尿被流体分泌主段（显示为红色）中产生，并朝向输尿管和流出到肠道内流动。解剖后，细管对被从肠道通过横断输尿管解离。 （B）的一对细管然后被转移到洗澡盐水的液滴内测定皿的孔中。其中的两个小管的，这里所指的“锚小管，”所缠绕的金属销和是惰性的。其他小管的分泌小管。起始段（其不分泌液）和分泌小管主体段保持洗澡盐水的液滴中。离子和水移动从洗澡盐水到主段的小管内腔，然后移向输尿管，正如在体内发生。下段（蓝色）是沐浴盐水，因此惰性外部。由于输尿管被切断时，分泌的流体出现从输尿管的切断端的液滴。 Ť他分泌流体液滴放大随时间而分泌的继续，其直径是使用目镜测微尺测定。矿物油的层防止分泌流体的蒸发。参考和离子专用电极测量分泌液的离子浓度。 请点击此处查看该图的放大版本。

Protocol

1.准备解剖，校准和检测菜注意：在此步骤中，衬有有机硅弹性体三个塑料培养皿制备：一个用于解剖，一个用于执行拉姆齐测定（“测定法菜”），和一个用于执行校准。这些菜都是重复使用的实验，实验，因此这个步骤只需要当一盘符重复。测定盘的图象示于图2。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload…

Representative Results

图7和8表明，使用拉姆齐测定用离子特异性电极来测量的 K + 和 Na +浓度可以区分基因和药理学上不同的 K + 和 Na +通量，即不通过单独测量流体分泌率捕获的信息。 图图7示出了从果蝇携带在NKCC纯合无效突变降低流体分泌小管是通过以K +流中的突变体（图7A）的下降驱动，而Na +的磁通没有改变（图…

Discussion

使用该拉姆齐检测，加上离子特定电极，允许液体分泌率和离子流的隔离昆虫马氏（肾）管的测量。二十个或更多小管可以一次进行测定，从而允许更高的吞吐量相比，个别的体外 microperfused小管的测定法。此外，离子特定电极允许在原位分泌液中的离子浓度的测定，从而限制了可以在小体积的流体至第二装置的转移而引入的误差。在协议中的关键步骤包括确保小管切开而不租金或?…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.