Anvendelse af Ramsay-analysen til at måle Fluid sekretion og Ion Flux priser i<em> Drosophila melanogaster</em> Malpighian tubulus

Summary

Denne protokol beskriver anvendelsen af Ramsay assay til måling af væske sekretionshastigheder fra isolerede Malpighian (renal) tubuli fra Drosophila melanogaster. Desuden anvendelsen af ​​ionspecifikke elektroder måler natrium og kalium koncentrationer i den udskilte væske, tillader beregning af transepitel ion flux, er beskrevet.

Abstract

Modulation af renal epitelial iontransport tillader organismer for at opretholde ioniske og osmotisk homeostase i ansigtet af varierende ydre forhold. Drosophila melanogaster Malpighian (renal) tubulus tilbyder en enestående mulighed for at studere de molekylære mekanismer i epitel iontransport, på grund af de kraftige genetik på denne skadegører, og tilgængeligheden af sine nyretubuli til fysiologisk undersøgelse. Her beskriver vi anvendelsen af ​​Ramsay assay til måling af væske sekretionshastigheder fra isoleret flyve nyretubuli, med anvendelse af ionspecifikke elektroder til måling af natrium og kalium koncentrationer i den udskilte væske. Dette assay muliggør undersøgelse af transepitel væske og ionstrømme af ~ 20 tubuli ad gangen, uden at det er nødvendigt at overføre den udskilte væske til en separat apparat til måling af ionkoncentrationer. Genetisk distinkte tubuli kan analyseres for at vurdere rollen af ​​specifikke gener i transportprocesser. Derudover bathing saltvand kan ændres til at undersøge virkningerne af sine kemiske egenskaber, eller narkotika eller hormoner tilføjet. Sammenfattende denne teknik tillader molekylær karakterisering af grundlæggende mekanismer i epitel iontransport i Drosophila tubulus, samt regulering af disse transportmekanismer.

Introduction

Renale epitel iontransport ligger til grund organismal iono- og osmoregulering. Drosophila melanogaster Malpighian (renal) tubulus tilbyder en enestående mulighed for at studere de molekylære mekanismer i epitelial ion transport. Dette skyldes kombinationen af de stærke genetik Drosophila, parret med tilgængeligheden af sine nyretubuli til fysiologisk undersøgelse. Ramsay assay, opkaldt efter den undersøger, som banebrydende teknik ^1, måler væskesekretion satser fra isolerede Malpighian tubuli, og blev etableret i Drosophila i 1994 af Dow og kolleger ^2. Dette banede vejen for yderligere undersøgelser ved hjælp af Drosophila genetiske værktøjer, såsom GAL4-UAS systemet ^3,4, for at definere celle-specifikke signalveje regulerer væske sekretion. Et eksempel omfatter calcium signalering som respons på et peptidhormon ^5, blandt mange andre ^6,7.

ve_content "> en kombination af genetiske teknikker og klassiske fysiologiske undersøgelse har vist, at urin generation i fluen sker gennem sekretion af et kaliumchlorid-rige væske fra hovedsegmentet af tubuli. Dette sker via den parallelle transepitel sekretion af kationer, primært K ⁺ men også Na ^+, gennem den primære celle og Cl ^-. sekretion gennem stjerneformet cellen ^8-12 Evnen til separat at måle transepiteliale K ⁺ og Na ⁺ flux giver en mere detaljeret karakterisering af transportmekanismer end måling af væske sekretion alene. For eksempel i ustimulerede Drosophila tubuli, Na ⁺ / K ⁺ -ATPase-inhibitoren ouabain har ingen effekt på fluid sekretion ^2, selv når dets optagelse i celler vigtigste inhiberes af organisk aniontransporter inhibitor taurocholat ^13. Imidlertid Linton og O'Donnell viste, at ouabain depolarisererden basolaterale membran potentiale, og øger Na ⁺ flux ^9. Som vist i Repræsentative resultater, vi gentaget disse resultater, og viste, at ^K + flux er samtidig faldet ^14; den øgede Na ⁺ flux og faldt K ⁺ flux har modsatrettede virkninger på fluid sekretion, hvilket resulterer i nogen nettoændring i sekretion. Der er således to beslutninger til "ouabain paradoks", dvs. den oprindelige iagttagelse, at ouabain har nogen virkning på fluid sekretion i Drosophila tubulus:. Dels i stimulerede tubuli, virkningen af ouabain på fluid sekretion fremgår ikke på grund af dens optagelse af organisk aniontransporter ^13; og for det andet i ustimulerede tubuli, ouabain har modstående virkninger på transepitelialt Na ⁺ og K ⁺ flux, hvilket resulterer i nogen nettoændring i fluid sekretion (se Repræsentative resultater og ref. 9). Derfor er den primære rolle af Na ⁺ / ^K + ATPase i ustimulerede tubuli er at sænke intracellulære Na ⁺ koncentration til at frembringe en positiv koncentrationsgradient for Na ⁺ -coupled transportprocesser på tværs af basolaterale membran. Faktisk ved separat måling Na ^{+ og} K + fluxe, vi påvist, at tubuli mangler fluen natrium-kalium-2-chlorid cotransportøren (NKCC) er faldet transepitelial K ⁺ flux, uden yderligere fald efter ouabain Desuden, og ingen ændring i transepitel Na ⁺ flux ^14. Disse resultater støttede vores konklusion, at Na ⁺ ind i cellen gennem NKCC recirkuleres gennem Na ⁺ / K ⁺ -ATPase. I et andet eksempel Ianowski et al. Observerede, at en sænkning bad K ⁺ koncentration fra 10 mM til 6 mM reduceret transepitheliale K ⁺ flux og forøget transepitel Na ⁺ flux i tubuli fra Rhodnius prolixus, med nogen nettoændring i fluid sekretion <sup> 15. Forskellige virkninger på Na ⁺ flux og K ⁺ flux på tværs af larver tubuli er også blevet observeret i Drosophila tubuli som reaktion på varierende salt kost ¹⁶ og i to myg arter som reaktion på opdræt saltholdighed ^17.

Den største udfordring i målingen af ​​transepitelial ion flux i Ramsay assay forberedelse er bestemmelsen af ​​ion koncentrationer inden det udskilte væske. Denne udfordring er blevet mødt med varierende løsninger, herunder flamme photometery ^18, anvendelse af radioaktive ioner ^19, og elektron sonde bølgelængde dispersivt spektroskopi ^20. Disse teknikker kræver overførsel af den udskilte væske fald til et instrument til måling af ionkoncentrationer. Da mængden af væske, der udskilles af den ustimulerede Drosophila tubulus er lille, typisk ~ 0,5 nl / min, udgør det en teknisk udfordring, og også indfører fejl, hvis nogle af de udskilte væsketabt ved overførsel. I modsætning hertil anvendelsen af ionspecifikke elektroder tillader måling af ion aktivitet (hvorfra der kan beregnes ionkoncentration) in situ. Den nuværende protokol blev tilpasset fra den, der anvendes af Maddrell og kolleger til at måle transepitel K ⁺ flux på tværs af Rhodnius tubulus hjælp valinomycin som K ⁺ ionofor ²¹ og beskriver også anvendelsen af en 4-tert -butylcalix [4] aren-tetraeddikesyre tetraethylester-baserede ^Na + -specifik ion-specifik elektrode kendetegnet ved Messerli et. al. ^22. Ion-specifikke elektroder er også blevet anvendt til at måle ion koncentrationer i væske, der udskilles af Malpighian tubuli i Ramsay assay voksne ^9,23 og larver ¹⁶ Drosophila melanogaster, New Zealand Alpine Weta (Hemideina ^Maori) 24 og myg ^17.

Her beskriver vi i detaljer brugen af ​​Ramsay somsige at måle fluid sekretionshastigheder i Malpighian tubuli fra Drosophila melanogaster, samt anvendelsen af ionspecifikke elektroder til at bestemme koncentrationerne af K ⁺ og Na ⁺ i den udskilte væske og dermed beregningen af transepitelialt ionstrømme. En oversigt over assayet er tilvejebragt i figur 1.

Figur 1. Skematisk af Malpighian tubuli og Ramsay-analysen med brug af Ion-specifikke elektroder til måling ionkoncentrationer. Denne figur illustrerer opsætningen for Ramsay analysen. (A) Hver flue har fire tubuli, et par anteriore tubuli og et par posteriore tubuli, der flyder i bughulen omgivet af hæmolymfe. I hvert par, de to tubuli deltage i urinlederen, som derefter tømmer urinen ved krydset af mellemtarmen og hindgut. Tubuliene er blinde ender. Urin frembringes af fluid-udskillende hovedsegmentet (vist med rødt) og strømmer mod ureter og ud i tarmen. Efter dissektion bliver tubulus parret adskilt fra tarmen ved transecting ureter. (B) Parret af tubuli overføres derefter til en dråbe saltvand badning inden for en brønd i assay skålen. En af de to tubuli, der er nævnt her som "anker tubulus," er viklet omkring en metalstang og er inert. Den anden tubulus er udskillende tubulus. Den indledende segment (som ikke udskiller væske) og vigtigste segment af secernerer tubulus forbliver inden for dråbe badning saltvand. Ioner og vand træk fra badning saltvand og ind i tubulus lumen de vigtigste segment, og derefter bevæge sig mod ureter, som ville forekomme in vivo. Den nederste segment (blå) er uden for badning saltvand og derfor inaktivt. Da ureter skæres, fremgår det secernerede fluid som en dråbe fra den afskårne ende af ureter. Than udskilte væske dråbe forstørrer, efterhånden som sekretion fortsætter, og dens diameter er målt ved anvendelse af en okulær mikrometer. Et lag af mineralolie forhindrer fordampning af det udskilte væske. Reference- og ion specifikke elektroder måler ion koncentrationen af det udskilte væske. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Forberedelse dissektion, kalibrering og Assay Retter Bemærk: I dette trin, er tre petriskåle af plast foret med silikone elastomer fremstillet: én for dissektion, en til udførelse af Ramsay assay ("assay skål"), og én til at udføre kalibrering. Disse retter er genbruges fra eksperiment til eksperiment, og dermed dette trin skal kun gentages, hvis en skål pauser. Et billede af assayet skålen er vist i figur 2. <p class="jove_content" fo:keep-toge…

Representative Results

Figur 7 og 8 viser, at brugen af Ramsay assay med ionspecifikke elektroder til måling af K + og Na + koncentration kan skelne genetisk og farmakologisk særskilte K + og Na + flusmidler, oplysninger, der ikke fanget ved måling fluid sekretionshastigheder alene. Fig 7 viser, at faldet fluid sekretion i tubuli mod fluer bærer en homozygot nul mutation i NKCC drives af et fald i K + flux i mutanterne (Figur 7A), men…

Discussion

Brugen af ​​Ramsay assay sammen med ionspecifikke elektroder, tillader måling af væske sekretionshastigheder og ionstrømme i isoleret insekt Malpighian (nyre) tubuli. Tyve eller flere tubuli kan analyseres ad gangen, giver højere gennemløb i forhold til assayet individuelle in vitro microperfused tubuli. Desuden ionspecifikke elektroder tillader bestemmelse af ionkoncentrationer i den udskilte væske i situ, begrænse fejl, der kan indføres i overførsel af små volumener af væske t…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.