रामसे परख के उपयोग में द्रव का स्राव और आयन प्रवाह दर को मापने के लिए<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em> Malpighian छोटी नली

Summary

इस प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर से पृथक Malpighian (गुर्दे) नलिकाओं से तरल पदार्थ का स्राव दर को मापने के रामसे परख के उपयोग का वर्णन। इसके अलावा, आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड का उपयोग transepithelial आयन प्रवाह की गणना के लिए अनुमति देता है, स्रावित तरल पदार्थ में सोडियम और पोटेशियम सांद्रता को मापने के लिए, वर्णित है।

Abstract

गुर्दे की उपकला आयन परिवहन के मॉड्यूलेशन जीवों बाहरी स्थिति बदलती का सामना करने में आयनिक और आसमाटिक homeostasis को बनाए रखने की अनुमति देता है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर Malpighian (गुर्दे) छोटी नली की वजह से इस जीव और शारीरिक अध्ययन करने के लिए अपने गुर्दे की नलिकाओं की पहुंच के शक्तिशाली आनुवंशिकी के लिए, उपकला आयन परिवहन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय अवसर प्रदान करता है। यहाँ, हम स्रावित तरल पदार्थ में सोडियम और पोटेशियम सांद्रता को मापने के लिए आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड के उपयोग के साथ, अलग-थलग मक्खी वृक्क नलिकाओं से तरल पदार्थ का स्राव दर को मापने के रामसे परख के उपयोग का वर्णन। इस परख आयन सांद्रता को मापने के लिए एक अलग तंत्र के लिए स्रावित तरल पदार्थ को हस्तांतरण करने की आवश्यकता के बिना, 20 नलिकाओं एक समय में की transepithelial तरल पदार्थ और आयन अपशिष्टों का अध्ययन ~ अनुमति देता है। आनुवंशिक रूप से अलग नलिकाओं परिवहन प्रक्रियाओं में विशिष्ट जीन की भूमिका का आकलन करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, खathing खारा जोड़ा अपने रासायनिक विशेषताओं, या दवाओं या हार्मोन के प्रभाव की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। सारांश में, इस तकनीक को इन परिवहन तंत्र की उपकला आयन ड्रोसोफिला छोटी नली में परिवहन, साथ ही विनियमन के बुनियादी तंत्र की आणविक लक्षण वर्णन अनुमति देता है।

Introduction

गुर्दे उपकला आयन परिवहन जीवधारी iono- और osmoregulation underlies। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर Malpighian (गुर्दे) छोटी नली उपकला आयन परिवहन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय अवसर प्रदान करता है। यह शारीरिक अध्ययन करने के लिए अपने गुर्दे की नलिकाओं की पहुंच के साथ रखा ड्रोसोफिला के शक्तिशाली आनुवंशिकी के संयोजन की वजह से है। तकनीक ¹ जो बीड़ा अन्वेषक के नाम पर रखा रामसे परख, पृथक Malpighian नलिकाओं से तरल पदार्थ का स्राव दरों के उपाय, और डॉव और उनके सहयोगियों ² द्वारा 1994 में ड्रोसोफिला में स्थापित किया गया था। यह तरल पदार्थ का स्राव को विनियमित सेल विशिष्ट संकेत दे रास्ते को परिभाषित करने के लिए, ड्रोसोफिला ऐसे GAL4 यूएएस सिस्टम ^3,4 के रूप में आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग करते हुए आगे की पढ़ाई के लिए मार्ग प्रशस्त किया। एक उदाहरण के कई अन्य लोगों के ^6.7 के बीच एक पेप्टाइड हार्मोन ⁵ के जवाब में कैल्शियम संकेतन, शामिल हैं।

मक्खी छोटी नली का मुख्य क्षेत्र से एक पोटेशियम क्लोराइड युक्त तरल पदार्थ का स्राव के माध्यम से होता है में ve_content "> आनुवंशिक तकनीक और शास्त्रीय शारीरिक अध्ययन का एक संयोजन है कि मूत्र पीढ़ी को दिखाया गया है। यह मुख्य रूप से, फैटायनों की समानांतर transepithelial स्राव के माध्यम से होता है ⁺ K लेकिन यह भी ना ^+, प्रिंसिपल सेल, और सीएल के माध्यम से ^-। ताराकार सेल ^8-12 के माध्यम से स्राव अलग transepithelial कश्मीर ⁺ और ​​ना ⁺ अपशिष्टों को मापने की क्षमता तरल पदार्थ का स्राव की माप से परिवहन तंत्र की एक अधिक विस्तृत लक्षण वर्णन अनुमति देता है अकेले। उदाहरण के लिए, unstimulated ड्रोसोफिला नलिकाओं में, ना ⁺ / ⁺ K -ATPase अवरोध करनेवाला ouabain तरल पदार्थ का स्राव ² पर कोई प्रभाव नहीं है, प्राचार्य कोशिकाओं में अपनी तेज जैविक आयनों ट्रांसपोर्टर अवरोध करनेवाला taurocholate ¹³ से हिचकते हैं, तब भी जब। हालांकि, Linton और ओडोनेल ouabain depolarizes पता चला है किबसोलातेरल झिल्ली क्षमता है, और ना ⁺ प्रवाह ⁹ बढ़ जाती है। प्रतिनिधि परिणाम में दिखाया गया है, हम इन निष्कर्षों को दोहराया है, और समन्वित रूप से ¹⁴ की कमी हुई है ⁺ K प्रवाह है कि पता चला है; बढ़ी हुई ना ⁺ प्रवाह और कश्मीर में कमी आई ⁺ प्रवाह स्राव में कोई शुद्ध परिवर्तन के परिणामस्वरूप तरल पदार्थ का स्राव पर विरोध करने प्रभाव है। । इस प्रकार, "ouabain विरोधाभास," यानी करने के लिए दो प्रस्तावों देखते हैं, ड्रोसोफिला छोटी नली में तरल पदार्थ का स्राव पर कोई प्रभाव नहीं है ouabain कि प्रारंभिक अवलोकन: पहला, उत्तेजित नलिकाओं में तरल पदार्थ का स्राव पर ouabain का प्रभाव स्पष्ट नहीं है के कारण जैविक आयनों ट्रांसपोर्टर ¹³ से इसकी तेज; और दूसरा, unstimulated नलिकाओं में, ouabain (प्रतिनिधि परिणाम और रेफरी को देखते हैं। 9) तरल पदार्थ का स्राव में कोई शुद्ध परिवर्तन के परिणामस्वरूप, transepithelial ना ⁺ और ​​कश्मीर ⁺ प्रवाह पर प्रभाव का विरोध किया है। इसलिए, ^ना की प्राथमिक भूमिका / ⁺ K -ATPunstimulated नलिकाओं में एएसई ना ⁺ basolateral झिल्ली भर में परिवहन प्रक्रियाओं -coupled के लिए एक अनुकूल एकाग्रता ढाल उत्पन्न करने के लिए इंट्रासेल्युलर ना ⁺ एकाग्रता कम करने के लिए है। दरअसल, अलग से ना ⁺ और ​​कश्मीर ⁺ अपशिष्टों को मापने के द्वारा, हम नलिकाओं मक्खी सोडियम पोटेशियम-2-क्लोराइड cotransporter (NKCC) की कमी ouabain इसके बाद कोई और कमी के साथ, transepithelial ⁺ K प्रवाह में कमी आई है, और transepithelial में कोई बदलाव नहीं आया है कि प्रदर्शन ना ^{+ 14} प्रवाह। इन निष्कर्षों NKCC के माध्यम से सेल में प्रवेश ^ना ना ⁺ / ⁺ K -ATPase के माध्यम से साफ किया है कि हमारे निष्कर्ष का समर्थन किया। एक अन्य उदाहरण में, Ianowski एट अल। मिमी 10 मिमी से 6 को स्नान ⁺ K एकाग्रता को कम तरल पदार्थ का स्राव में कोई शुद्ध परिवर्तन के साथ, Rhodnius prolixus से नलिकाओं में transepithelial ⁺ K प्रवाह और बढ़ transepithelial ना ⁺ प्रवाह में कमी आई कि मनाया <sup> 15। लार्वा नलिकाओं भर ना ⁺ प्रवाह और कश्मीर ⁺ प्रवाह पर अंतर प्रभाव भी लवणता ¹⁷ के पालन के जवाब में बदलती नमक वाले भोजन ^{से 16} और दो ​​मच्छर प्रजातियों में प्रतिक्रिया में ड्रोसोफिला नलिकाओं में मनाया गया है।

रामसे परख तैयारी में transepithelial आयन प्रवाह की माप में सबसे बड़ी चुनौती स्रावित तरल पदार्थ के भीतर आयन सांद्रता का दृढ़ संकल्प है। इस चुनौती लौ photometery ^18, रेडियोधर्मी आयनों ¹⁹ का उपयोग करते हैं, और इलेक्ट्रॉन जांच तरंगदैर्ध्य फैलानेवाला स्पेक्ट्रोस्कोपी ²⁰ सहित अलग-अलग समाधान के साथ मिला दिया गया है। इन तकनीकों में आयन सांद्रता की माप के लिए एक उपकरण के लिए स्रावित तरल पदार्थ बूंद के हस्तांतरण की आवश्यकता है। Unstimulated ड्रोसोफिला छोटी नली द्वारा स्रावित तरल पदार्थ की मात्रा कम है, आमतौर पर ~ 0.5 nl / मिनट, यह एक तकनीकी चुनौती बन गया है और स्रावित तरल पदार्थ के कुछ है, तो भी त्रुटि परिचयहस्तांतरण पर खो दिया है। इसके विपरीत, आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड का उपयोग सीटू (आयन एकाग्रता की गणना की जा सकती है, जिसमें से) आयन गतिविधि की माप की अनुमति देता है। वर्तमान प्रोटोकॉल कश्मीर ⁺ ionophore ²¹ के रूप में valinomycin का उपयोग कर Rhodnius छोटी नली भर transepithelial ⁺ K प्रवाह को मापने के लिए Maddrell और उनके सहयोगियों द्वारा इस्तेमाल किया है कि से अनुकूलित, और यह भी एक 4 tert -butylcalix [4] arene-tetraacetic एसिड के उपयोग का वर्णन किया गया था, tetraethyl एस्टर आधारित ना Messerli एट द्वारा विशेषता -specific आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड ^+। अल। ^22। आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड भी वयस्क ^9,23 और लार्वा ¹⁶ ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में रामसे परख में Malpighian नलिकाओं द्वारा स्रावित तरल पदार्थ में आयन सांद्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है, न्यूजीलैंड अल्पाइन Weta (Hemideina माओरी) ²⁴ और मच्छरों ¹⁷ में।

यहाँ, हम विस्तार में रामसे के उपयोग के रूप का वर्णनतरल पदार्थ का स्राव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर से Malpighian नलिकाओं में दरों, साथ ही स्रावित तरल पदार्थ के भीतर कश्मीर ⁺ और ​​ना ⁺ की सांद्रता निर्धारित करने के लिए आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड का इस्तेमाल करते हैं और इस प्रकार transepithelial आयन अपशिष्टों की गणना के उपाय करने के लिए कहते हैं। परख का एक सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रदान की जाती है।

Malpighian नलिकाओं की चित्रा 1. योजनाबद्ध और आयन सांद्रता उपाय करने के लिए आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड का उपयोग के साथ रामसे परख। यह आंकड़ा रामसे परख के लिए सेटअप को दिखाता है। (ए) प्रत्येक मक्खी चार नलिकाओं, पूर्वकाल नलिकाओं की एक जोड़ी और पीछे नलिकाओं की एक जोड़ी, hemolymph से घिरा हुआ उदर गुहा में है कि नाव है। प्रत्येक जोड़ी में, दो नलिकाओं तो आद्यमध्यांत्र और hindgu के जंक्शन पर मूत्र खाली जो मूत्रवाहिनी, में शामिल होने केटी। नलिकाओं अंधा समाप्त कर रहे हैं। मूत्र (लाल रंग में दिखाया गया है) द्रव स्रावित मुख्य खंड द्वारा उत्पन्न, और पेट में मूत्रवाहिनी की ओर और बाहर बहती है। विच्छेदन के बाद, छोटी नली जोड़ी मूत्रवाहिनी transecting द्वारा पेट से अलग है। (बी) नलिकाओं की जोड़ी तो परख पकवान की एक अच्छी तरह से भीतर स्नान खारा की एक छोटी बूंद में स्थानांतरित किया है। यहाँ के रूप में करने के लिए भेजा दो नलिकाओं में से एक, "लंगर छोटी नली," एक धातु पिन के चारों ओर लिपटा और निष्क्रिय है। अन्य छोटी नली स्रावित छोटी नली है। प्रारंभिक खंड (द्रव स्रावित नहीं करता है) और स्रावित छोटी नली का मुख्य खंड स्नान नमक की छोटी बूंद के भीतर रहते हैं। विवो में घटित होता है के रूप में तो आयनों और स्नान खारा से और मुख्य सेगमेंट की छोटी नली लुमेन में पानी ले जाने के लिए, और, मूत्रनली की ओर ले जाते हैं। निचले खंड (नीला) स्नान खारा है और इसलिए अक्रिय के बाहर है। मूत्रवाहिनी कट जाता है के बाद से, स्रावी द्रव मूत्रवाहिनी की कटौती अंत से एक छोटी बूंद के रूप में उभर रहे हैं। टीवह स्राव के रूप में जारी द्रव छोटी बूंद समय के साथ मायनों में इजाफा स्रावित, और इसका व्यास एक आंख का माइक्रोमीटर उपयोग मापा जाता है। खनिज तेल की एक परत स्रावित तरल पदार्थ का वाष्पीकरण से बचाता है। संदर्भ और आयन विशिष्ट इलेक्ट्रोड स्रावित तरल पदार्थ के आयन एकाग्रता को मापने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

1. तैयारी विच्छेदन, कैलिब्रेशन और परख व्यंजन नोट: इस चरण में, सिलिकॉन elastomer के साथ खड़े तीन प्लास्टिक पेट्री डिश तैयार कर रहे हैं: रामसे परख ("परख पकवान") के प्रदर्शन के लिए विच्छेदन के लिए एक, …

Representative Results

7 आंकड़े और 8 आनुवंशिक रूप से और औषधीय अलग + K और ना + अपशिष्टों, अकेले तरल पदार्थ का स्राव दरों को मापने के द्वारा कब्जा नहीं कर रहा है कि जानकारी भेद कर सकते हैं + K और ना + सांद्रता को मा…

Discussion

एक साथ आयन-विशिष्ट इलेक्ट्रोड के साथ रामसे परख का उपयोग करते हैं, अलग-थलग कीट Malpighian (गुर्दे) नलिकाओं में तरल पदार्थ का स्राव दरों और आयन अपशिष्टों की माप की अनुमति देता है। बीस या उससे अधिक नलिकाओं विट्र?…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.