El uso del ensayo de Ramsay medir la secreción de fluidos y de iones Flux tarifas en el<em> Drosophila melanogaster</em> Túbulo de Malpighi

Summary

Este protocolo describe el uso del ensayo de Ramsay para medir las tasas de secreción de fluidos aislados de Malpighi (renal) túbulos de Drosophila melanogaster. Además, el uso de electrodos de ión específico para medir las concentraciones de sodio y potasio en el líquido secretado, lo que permite el cálculo del flujo de iones transepitelial, se describe.

Abstract

La modulación de transporte de iones epiteliales renales permite a los organismos para mantener la homeostasis iónica y osmótica en la cara de la variación de las condiciones externas. La Drosophila melanogaster Malpighi (renal) túbulo ofrece una oportunidad sin precedentes para estudiar los mecanismos moleculares de transporte iónico epitelial, debido a los poderosos genética de este organismo y la accesibilidad de sus túbulos renales al estudio fisiológico. Aquí se describe el uso del ensayo de Ramsay para medir las tasas de secreción de líquido de los túbulos renales aislados de moscas, con el uso de electrodos de iones específicos para medir las concentraciones de sodio y potasio en el líquido secretado. Este ensayo permite el estudio de fluido transepitelial de iones y los flujos de ~ 20 túbulos a la vez, sin la necesidad de transferir el fluido secretado a un aparato separado para medir las concentraciones de iones. Genéticamente túbulos distintas se pueden analizar para evaluar el papel de genes específicos en procesos de transporte. Además, el bsolución salina athing puede ser modificado para examinar los efectos de sus características químicas o fármacos u hormonas añadidas. En resumen, esta técnica permite la caracterización molecular de los mecanismos básicos de transporte epitelial de iones en el túbulo Drosophila, así como la regulación de estos mecanismos de transporte.

Introduction

Transporte iónico epitelial renal subyace ionosfera del organismo y la osmorregulación. La Drosophila melanogaster Malpighi (renal) túbulo ofrece una oportunidad sin precedentes para estudiar los mecanismos moleculares de transporte iónico epitelial. Esto es debido a la combinación de las poderosas genética de Drosophila, emparejado con la accesibilidad de sus túbulos renales a estudio fisiológico. El ensayo de Ramsay, el nombre del investigador que fue pionero en la técnica ^1, mide las tasas de secreción de líquido de los túbulos de Malpighi aislados, y se constituyó en Drosophila en 1994 por Dow y colegas ^2. Esto allanó el camino para más estudios utilizando Drosophila herramientas genéticas, tales como el sistema GAL4-UAS ^3,4, para definir las vías de señalización de células específicas que regulan la secreción de fluidos. Un ejemplo incluye la señalización del calcio en respuesta a una hormona peptídica ^5, entre muchos otros ^6,7.

ve_content "> Una combinación de técnicas genéticas y estudio fisiológico clásica ha demostrado que la generación de la orina en el se produce la marcha a través de la secreción de un cloruro de potasio rica en líquido de la principal segmento del túbulo. Esto ocurre a través de la secreción transepitelial paralelo de cationes, principalmente K ⁺ Na ^+, sino también, a través de la célula principal, y Cl ^-. a través de la secreción de las células estrelladas ^8-12 La capacidad de medir por separado transepiteliales flujos de K ^{+ y} Na ^{+ permite} una caracterización más detallada de los mecanismos de transporte que la medición de la secreción de fluidos solo. Por ejemplo, en los túbulos de Drosophila no estimuladas, el Na ⁺ / K ⁺ -ATPasa ouabaína no tiene ningún efecto sobre la secreción de fluido ^2, incluso cuando su captación en las células principales se inhibe por el transportador de aniones orgánicos inhibidor de taurocolato ^13. Sin embargo, Linton y O'Donnell mostró que ouabaína despolarizael potencial de membrana basolateral, y aumenta Na ⁺ flujo ^9. Como se muestra en los resultados representativos, replicamos estos hallazgos, y demostramos que K ⁺ flujo es concomitante disminución de ^14; el aumento del flujo de Na ⁺ y la disminución de ^K + flujo tener efectos opuestos sobre la secreción de fluidos, lo que resulta en ningún cambio neto en la secreción. Por lo tanto, hay dos resoluciones a la "paradoja ouabaína", es decir, la observación inicial de que ouabaína no tiene ningún efecto sobre la secreción de fluido en el túbulo Drosophila:. Primero, en los túbulos estimulados, el efecto de ouabaína sobre la secreción de fluido no es evidente debido a la su absorción por el transportador de aniones orgánicos ^13; y en segundo lugar, en los túbulos no estimuladas, ouabaina ha oponerse efectos sobre transepitelial Na ⁺ y K ⁺ flujo, lo que resulta en ningún cambio neto en la secreción de fluidos (ver resultados representativos y ref. 9). Por lo tanto, la función principal de la Na ⁺ / K ⁺ -ATPase en los túbulos no estimuladas es disminuir la concentración intracelular de Na ⁺ para generar un gradiente de concentración favorable para ^Na + -junto procesos de transporte a través de la membrana basolateral. En efecto, mediante la medición por separado de Na ^{+ y K} + fundentes, hemos demostrado que los túbulos que carece del cotransportador sodio-potasio-2-cloruro de mosca (NKCC) han disminuido K transepitelial ⁺ fundente, sin mayor descenso después de la adición ouabaina, y ningún cambio en transepitelial Na ⁺ Flujo ^14. Estos resultados apoyan nuestra conclusión de que Na ⁺ entrar en la célula a través de la NKCC se recicla a través de la Na ⁺ / K ⁺ -ATPasa. En otro ejemplo, Ianowski et al. Observaron que la reducción de baño de K ⁺ concentración de 10 mM a 6 mM disminuyó transepitelial K ⁺ y el aumento de flujo transepitelial Na ⁺ en los túbulos flujo de Rhodnius prolixus, sin cambio neto en la secreción de fluidos <sup> 15. Efectos diferenciales sobre Na ⁺ y K ⁺ flujo flujo a través de los túbulos de larvas se han observado también en los túbulos de Drosophila en respuesta a diferentes dietas de sal ¹⁶ y en dos especies de mosquitos en respuesta a la cría de salinidad ^17.

El mayor reto en la medición del flujo de iones transepitelial en la preparación de ensayo Ramsay es la determinación de las concentraciones de iones dentro del fluido secretado. Este reto se ha cumplido con soluciones diferentes, incluyendo photometery llama ^18, el uso de iones radiactivos ^19, y el electrón sonda de longitud de onda de la espectroscopía dispersiva ^20. Estas técnicas requieren la transferencia de la gota de líquido secretado a un instrumento para la medición de concentraciones de iones. Dado que el volumen de líquido secretado por el túbulo Drosophila no estimulada es pequeño, típicamente ~ 0,5 nl / min, esto plantea un reto técnico y también introduce error si algo del fluido es secretadaperdido en la transferencia. En contraste, el uso de electrodos de ión específico permite la medición de la actividad de iones (a partir del cual se puede calcular la concentración de iones) in situ. El protocolo actual fue adaptado de la utilizada por Maddrell y sus colegas para medir transepitelial K ⁺ flujo a través de los túbulos Rhodnius usando valinomicina como el K ⁺ ionóforo ^21, y también describe el uso de un -butylcalix 4- terc [4] areno-ácido tetraacético Na base de éster de tetraetilo ⁺ específico de electrodo específico de iones caracterizado por Messerli et. al., ^22. Ion-electrodos específicos también se han utilizado para medir las concentraciones de iones en el fluido secretado por los túbulos de Malpighi en el ensayo de Ramsay en adulto y larval ^{9,23 16} Drosophila melanogaster, la Nueva Zelanda Alpine Weta (Hemideina maori) ²⁴ y ¹⁷ en los mosquitos.

Aquí se describe en detalle el uso del Ramsay comodecir para medir las tasas de secreción de fluidos en los túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster, así como el uso de electrodos de ión específico para determinar las concentraciones de K ⁺ y Na ⁺ en el fluido secretado y por lo tanto el cálculo de los flujos de iones transepitelial. Una visión general del ensayo se proporciona en la Figura 1.

Figura 1. Esquema del Malpighi túbulos y el ensayo de Ramsay con uso de iones específicos electrodos para medir concentraciones de iones. Esta figura ilustra la configuración para el ensayo de Ramsay. (A) Cada mosca tiene cuatro túbulos, un par de túbulos anterior y un par de túbulos posteriores, que flotan en la cavidad abdominal rodeado de hemolinfa. En cada par, los dos túbulos se unen en el uréter, que luego se vacía la orina en la unión del intestino medio y hindgut. Los túbulos son ciego terminado. La orina se genera por el segmento principal de fluido que secretan (mostrado en rojo), y fluye hacia el uréter y hacia fuera en el intestino. Después de la disección, el par túbulo se disocia desde el intestino por transección el uréter. (B) El par de túbulos se transfiere a continuación en una gota de solución salina de baño dentro de un pocillo de la placa de ensayo. Uno de los dos túbulos, que se refiere aquí como el "túbulo ancla," se envuelve alrededor de un pasador de metal y es inerte. El otro es el túbulo túbulo secretor. El segmento inicial (que no secretar fluido) y el segmento principal de los túbulos secretores se mantienen dentro de la gota de solución salina de baño. Iones y movimiento de agua de la solución salina de baño y en el lumen de los túbulos del segmento principal, y luego se mueven hacia el uréter, como ocurriría en vivo. El segmento inferior (azul) está fuera de la solución salina de baño y por lo tanto inerte. Desde el uréter se corta, el fluido secretado emerge como una gotita desde el extremo cortado del uréter. Tél secretada gotita de fluido aumenta con el tiempo como la secreción continúa, y su diámetro se mide utilizando un micrómetro ocular. Una capa de aceite mineral evita la evaporación del fluido secretado. Los iones de referencia y electrodos específicos miden la concentración de iones del líquido secretado. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Preparación de los platos, de calibración y ensayo de disección Nota: En este paso, se preparan tres placas de Petri de plástico forrados con elastómero de silicona: uno para la disección, uno para realizar el ensayo Ramsay ("plato de ensayo"), y uno para realizar la calibración. Estos platos se reutilizan de experimento a experimento, y por lo tanto este paso sólo necesita ser repetida si se rompe un plato. Una imagen de la placa de ensayo se muestra en</str…

Representative Results

Las Figuras 7 y 8 demuestran que el uso del ensayo de Ramsay con electrodos de ión específico para medir las concentraciones de K + y Na + puede distinguir genéticamente y farmacológicamente distintas K + y los flujos de Na +, la información que no se captura mediante la medición de las tasas de secreción de líquido solo. Figura 7 muestra que la disminución de la secreción de fluidos en los túbulos de las moscas que llevan una mutac…

Discussion

El uso del ensayo Ramsay, junto con electrodos de ión específico, permite la medición de tasas de secreción de fluidos y los flujos de iones en el aislado de insectos de Malpighi (renales) túbulos. Veinte o más túbulos se pueden ensayar a la vez, lo que permite un mayor rendimiento en comparación con el ensayo de individuo en túbulos in vitro microperfused. Además, los electrodos de ión específico permiten la determinación de las concentraciones de iones dentro del fluido secretado in …

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.