Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
Comprendre les mécanismes par lesquels les protéines membranaires remplir leur fonction cellulaire peut souvent être une tâche difficile, parce que leurs modes d'action sont souvent définis par des interactions de faible affinité, qui sont difficiles à détecter et à évaluer par des méthodes biochimiques classiques. Les protéines membranaires peuvent en outre être hautement enrichi dans des domaines membranaires spécifiques 5,6 ou former des structures d'ordre supérieur dynamiques, qui peuvent modifier, en principe, leur activité biologique 7.
Fluorescence de la molécule unique microscopie laser assistée non-invasive est ainsi devenue la méthode de choix pour étudier le comportement de la protéine dans des environnements cellulaires complexes. Ceci est vrai en particulier pour les processus biochimiques qui ont lieu à la membrane plasmique, car ceux-ci peuvent en principe être surveillés en mode bruit réduit réflexion interne totale (FRBR). Voici l'illumination de l'échantillon est restreint à une tranche jusqu'à 200 nm-mince à proximité un verre surface, ce qui entraîne une perte importante en arrière-plan cellulaire et, en raison des caractéristiques de la lumière d'excitation évanescente, également à une augmentation substantielle de l'intensité du signal de fluorescence 8,9. Les deux aspects sont importants lorsque l'objectif pour la résolution de position et temporelle dans la détection de la molécule unique.
Planar SLBS ne sont pas seulement compatible avec la FRBR microscopie. Lorsque fonctionnalisé avec des ligands appropriés ils fournissent également un accès direct à l'étude de la dynamique moléculaire de reconnaissance cellule-cellule comme ils se produisent dans les cellules immunitaires ou d'autres cellules. Ils peuvent également être utilisés simplement pour positionner cellules mobiles et autrement non adhérentes suffisamment à proximité de la lame de verre de telle sorte que de telles cellules peuvent être imagés dans TIRF illumination, ce qui est hautement souhaitable lorsque des expériences de conduction comportant un suivi de la molécule unique ou simple hyper-résolution sur la base molécule. A cette fin, les protéines doivent être chargées sur une SLB hautement mobile. Un avantage inhérent de la li utilisé PID sont qu'il n'y a pas de liaison non spécifique des protéines à tous. En outre, SLBS peuvent être considérés comme liquides à deux dimensions avec une capacité inhérente de se guérir; irrégularités dans le support de verre sont compensées jusqu'à un certain degré. Un protocole étape par étape est prévu pour générer bicouches très mobiles chargés de protéines d'intérêt. La formation de SLBS planes est décrite, qui contiennent 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC) comme ingrédient principal (90-99%) et le lipide fonctionnalisé synthétique et de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3 – {[N (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacétique acide] succinyl} nickel sel (DGS NTA-Ni) en faible abondance (1-10%). POPC une porte acide gras saturé et un acide gras mono-insaturé et forme des bicouches lipidiques de haute fluidité même à température ambiante. DGS NTA-Ni se lie avec son groupe de tête à la queue poly-histidine et sert de point d'ancrage pour des protéines poly-histidine de choix (figure 1).
"> Fait important, le matériel de microscopie doit inclure un certain nombre de périphériques qui sont décrits ci-dessous. Avec les informations fournies et quelques connaissances de base de l'optique et la physique des lasers, tout biologiste devrait être en mesure de construire une installation unique d'imagerie par molécule. Excitation échantillon devrait idéalement être réalisée sur un microscope inversé en mode de réflexion interne totale (FRBR) que ce régime réduit la lumière parasite et de fond excessif résultant autrement de cellulaire auto-fluorescence 9. Pour ce faire, un objectif de la FRBR capable spéciale (voir ci-dessous) et l'illumination laser sont nécessaires. Certaines expériences auront besoin de temps d'illumination dans la gamme de la milliseconde et exploité en succession rapide. Pour gagner du temps d'éclairage ou pour éviter le blanchiment inutiles causés par l'éclairage répétitive il est souvent utile de diviser la lumière émise en deux ou plusieurs canaux spectraux. Cela permet la lecture simultanée de deux ou plusieurs profils d'émission, qui peuvent devenir un facteur important lorsque conducTing expériences impliquant le transfert d'énergie par résonance Förster (FRET). Voici l'émission résultant d'une impulsion de lumière d'excitation unique peut être enregistrée à la fois du donneur FRET et accepteur FRET (comme l'émission sensibilisés). La caméra doit capturer suffisamment de photons avec suffisamment faible fond de visualiser fluorophores simples pendant le temps d'éclairage. Logiciels devra être à la hauteur de synchroniser excitation fermeture et l'acquisition de l'image. Une vue d'ensemble est donnée ci-dessous et à la figure 2:Objectif de la FRBR capable: Pour la FRBR éclairage axé sur les objectifs de l'ouverture numérique (NA) de l'objectif doit être égale ou supérieure à 1,4 en utilisant des lames de verre standard (n = 1.515) 9. Grossissement peut varier entre 60x à 150 fois. L'objectif devrait être corrigé chromatiquement pour permettre confocalité lors de l'imagerie des fluorophores différents.
Lasers: Le nombre de disponibles laseoptions de R a considérablement augmenté au cours des dernières années. Modernes électroniquement modulables diodes lasers à onde continue sont rentables et peuvent être exploités avec une fréquence sans précédent et la vitesse. Plus coûteux lasers à ions de gaz à exceller dans la qualité de faisceau laser, mais nécessitent fermeture externe (voir ci-dessous) et souvent vaste (eau) de refroidissement.
Excitation volets: modulateurs acousto-optique (AOM) permettent fermeture rapide en succession rapide 10. Pour la fermeture étanche de la combinaison d'un AOM avec des volets mécaniques est recommandée. De cette façon, le chauffage étendue de l'OMA dues à l'exposition de lumière continue est évitée et la lumière fuite de l'AOM dans la position d'arrêt est annulé.
Les lentilles sont utilisés pour élargir les faisceaux laser et de les concentrer sur le plan focal arrière de l'objectif. De cette façon, la lumière d'excitation laisse l'objectif comme un faisceau parallèle (Figure 3), qui est nécessaire pour l'illumination de la FRBRl'échantillon. Le déplacement du point focal au sein du plan focal arrière du centre à la périphérie de l'objectif va changer l'angle sous lequel le faisceau quitte l'objectif, mais pas l'emplacement de la tache laser sur l'échantillon (Figure 3), qui est une fonction de la géométrie globale du faisceau. Éclairage FRBR découle à un angle critique, qui peut être ajustée en utilisant un jeu de miroirs fonctionnant comme un périscope pour traduire le point focal du laser dans le plan focal de l'objectif. Les lentilles doivent être corrigées chromatiquement et peuvent être utilisés dans un ensemble de deux ou trois lentilles. Un système à trois lentille se compose de deux lentilles qui agissent comme un télescope pour élargir le faisceau laser (et donc le point d'illumination à l'échantillon) et une troisième lentille pour focaliser le faisceau élargie dans le plan focal arrière de l'objectif (Figure 4). Ces deux fonctions (télescope et mise au point) peuvent également être obtenus par une combinaison de deux lentilles seulement (voir Figure 4).
<p class="jove_content"> Miroirs devrait être d'au moins 95% de réflexion pour éviter la perte de la lumière laser. Pour chaque réglage du faisceau d'un ensemble de deux miroirs est généralement appliqué comme tel arrangement est suffisante pour ajuster précisément quel angle et la position d'un faisceau laser.Superpositions dichroïques reflètent et transmettent la lumière de différentes longueurs d'onde spécifiées et sont utilisés pour superposer ou séparer les faisceaux de deux lasers.
Polychroic filtres sont plus complexes que les filtres dichroïques et sont nécessaires pour refléter la lumière d'excitation entrant et sortant de transmettre la lumière d'émission de l'échantillon. Ils sont placés dans le cube de filtre entre l'objectif et la lentille de tube du microscope.
Nettoyez les filtres: Selon le type d'employé laser d laser nettoyer les filtres avec une bande passante de transmission étroite doit être placé dans le faisceau laser droite après avoir quitté le laser.
Filtres Notchsont conçus pour absorber efficacement la lumière laser avec une bande passante étroite et transmettre toute autre lumière. Ils sont placés dans le chemin d'émission pour filtrer toute lumière d'excitation de laser parasite. Cependant, les filtres notch fonctionnent uniquement à 0 ° angle entrant. Si la largeur de bande du filtre Notch est très forte, les différents angles entrants ne soient pas reflétés plus. Blocage de la lumière laser laser collimaté est pas affectée, mais la lumière diffusée en retour pourrait ne pas être efficacement empêché d'atteindre la caméra.
Roues à filtres motorisés équipés de roues de filtres appropriés peuvent être facilement placés dans la voie d'excitation et d'émission et permettent une commutation simple entre les différentes intensités lumineuses (lorsqu'il est équipé de filtres ND) ou canaux fluorescents (lorsqu'il est placé devant une lampe à arc xénon ou mercure ratiométrique imagerie de calcium ou en face de la caméra pour sélectionner pour le fluorophore électroluminescente).
50:50 cube diviseur de faisceau cun être utilisés pour diviser les faisceaux laser en deux trajets de faisceaux d'excitation séparés et aussi de les combiner en face du périscope.
Diviseur de faisceau (trajet d'émission): Pour l'acquisition rapide d'images sans avoir besoin de changements de filtres physiques, le faisceau d'émission est divisée en un canal décalée vers le bleu et décalée vers le rouge. En principe, les diviseurs de faisceau peuvent être construits en utilisant un coin dichroïque ou un ensemble de miroirs et un miroir dichroïque pour séparer le faisceau d'émission d'une manière dépendant de la longueur d'onde. Deux filtres d'émission sont nécessaires pour nettoyer les canaux émis.
Filtre spatial: filtrage spatial du faisceau d'excitation est parfois nécessaire de retirer des rayons de lumière non parallèles émis par des faisceaux laser de faible qualité. Un filtre spatial est constitué d'un télescope de deux lentille avec un petit trou placé exactement au point focal de deux lentilles. De cette façon, la lumière parasite résultant de parties non parallèles du faisceau laser devient efficacement bloqué. Such conditions doivent être remplies lors de l'établissement microscopie basée sur la FRBR. Les augmentations de filtrage spatial avec de petits trous d'épingle, qui sont plus difficiles à placer dans le point focal, et avec des focales plus petits de la première lentille. Pour réduire les effets causés par les aberrations d'objectif, il est avantageux d'utiliser à la place de lentilles simples de haute qualité et les objectifs de microscope corrigé à l'infini avec un faible grossissement (10x ou 20x).
Periscope: Une configuration périscope est nécessaire de traduire le faisceau laser focalisé dans le plan focal arrière de l'objectif, une condition préalable pour l'imagerie de la FRBR. Il peut être facilement construit à partir de deux miroirs deux pouces, une étape de translation pour ajuster le premier miroir et un poste de positionnement du deuxième miroir pour réfléchir le faisceau concentré élargi et d'excitation dans le microscope (Figure 5).
Appareil photo: rétro-éclairé Electron multipliant Charge Coupled Devices (EMCCD) sont couramment utilisés pourl'enregistrement de signaux de molécules simples. Ceci est en raison de leur rendement quantique élevé (jusqu'à 95%), vitesse d'acquisition (jusqu'à 30 MHz) et relativement faible bruit. Refroidissement à -80 ° C réduit le bruit thermique et est soutenu par un certain nombre de caméras EMCCD actuellement disponibles. Une limitation de la technologie EMCCD est que le bruit de la caméra augmente linéairement avec la fois le gain de la caméra et le signal étant capturée. Cela ne veut pas le cas avec les scientifiques CMOS (sCMOS) appareils photo, qui sont nettement moins coûteux et fonctionnent grâce à l'architecture particulière de la puce sCMOS également beaucoup plus rapide que les caméras EMCCD. Toutefois, un problème associé à la technologie CMOS est que l'acquisition d'images n'a pas toujours un certain degré d'une lecture quantitative sur un niveau unique molécule, car chaque pixel possède une sensibilité de détection différent. En principe, ceci peut être compensé par pixel normalisation, mais cette procédure est loin d'être triviaux 11. Voilà pourquoi nous hésitons encore à nouveauféliciter caméras sCMOS pour la microscopie de molécule unique, mais compte tenu de l'évolution rapide de cette technologie, les caméras sCMOS pourraient bientôt devenir la caméra de choix. Lenteur caméras CCD à balayage caméras éviter le bruit et les pixel écart lié amplification tous ensemble et de soutenir les plus rapides des taux d'acquisition si elles peuvent être utilisées dans un mode dit «cinétique». Dans ce mode, l'ensemble de la puce de la caméra, sauf pour une région d'intérêt (ROI) est masqué, ce qui permet d'employer la puce elle-même comme un périphérique de stockage. Après le retour sur investissement est exposé pour la première fois, les charges résultant sont décalés dans la zone masquée de la ligne puce de pixel par ligne de pixels, où l'image est protégée contre de futures exposition à la lumière. Une fois que le déplacement de toutes les lignes de la ROI dans la zone masquée est terminée (dans la plage inférieure à la milliseconde), elle-même la ROI est prêt pour la prochaine exposition. Ce cycle est répété jusqu'à ce que toutes les lignes de pixels de la puce CCD sont facturés. La puce est ensuite lu lentement avec nettement Redubruit de lecture CED. Par exemple sur une puce de pixels 1000 x 1300, 20 ROI de 50×50 pixels peuvent être enregistrées en succession rapide. Parce que les images restent sur la puce pendant un temps considérable avant d'être lu, il est essentiel de veiller à masquage de haute qualité et à refroidir la caméra (par exemple avec de l'azote liquide) comme un moyen de réduire le bruit thermique excessive. Certaines caméras EMCCD prennent également en charge le mode cinétique.
Logiciel: Calendrier des lasers, des volets, AOMS et exposition de l'appareil ainsi que le stockage d'image correcte font partie intégrante de toute expérience d'imagerie succès. En principe, de nombreuses opérations définies peuvent être programmées avec des logiciels disponibles qui viennent avec la caméra. Progiciels commerciaux supportent un grand nombre de périphériques matériels, qui peuvent être mises en œuvre avec peu de savoir-faire technique.
Générateur d'impulsion, d'acquisition de données (DAQ) conseil (avec canaux de sortie analogiques et numériques) et l'oscilloscope: Un générateur d'impulsions est unexcellent choix pour convertir des impulsions de déclenchement en impulsions de temps et de tension définie. De cette façon, les lasers peuvent être contrôlés précisément pour la puissance de sortie et au moment opportun de la milliseconde à la gamme inférieure à la milliseconde. Cartes DAQ avec sorties analogiques atteindre le même et sont facilement intégrés dans la carte mère de l'ordinateur via les slots PCI. La durée d'impulsion, amplitude et la fréquence sont vérifiées avec un oscilloscope.
Boîtier de l'ensemble du trajet du faisceau d'excitation: Pour éviter des fluctuations dans le profil d'excitation due à convections de l'air tout le trajet du faisceau d'excitation doit être joint à partir de son environnement de laboratoire. Cette mesure est particulièrement important lors de la conduite microscopie FRBR. Les composants optiques sont également protégés contre la poussière et l'oeil humain à partir de l'exposition de lumière laser. Boîtiers peuvent être facilement construire à partir de carton noir, qui peut être acheté dans les magasins de fournitures d'arts.
Pour déterminer la fluidité de la reprise SLB fluorescence après Photobleaching (FRAP) 12 mesures sont effectuées. Pour FRAP l'existence de deux chemins de faisceau d'excitation est conseillé (voir Figure 3). Le premier trajet de faisceau est conçu pour l'image de la fluorescence de la bicouche. Cela peut être fait dans la configuration de la FRBR et avec une faible intensité lumineuse. Le second trajet de faisceau devrait permettre une impulsion de blanchiment courte mais intense et doit être configuré dans le mode non-TIRF, de sorte qu'il quitte l'objectif le long de l'axe optique. Une ouverture ronde peut être placé dans le trajet du faisceau d'excitation (voir la Figure 8) pour projeter un profil de blanchiment parfaitement rond avec des bords définis. Pour l'image de cette ouverture sur le plan de l'objet, sa position optimale serait dans le plan focal de l'objectif 3 (voir Figure 3). Toutefois, en raison de la longue distance focale de cette lentille, une image d'ouverture d'une qualité suffisante peut également être générée, lorsque l'ouverture est placée au niveau de positions décalées légèrement.
Après avoir effectué til imagerie expérience, les données brutes doivent être analysés de manière appropriée. Plusieurs protocoles étape-par-étape sont offerts, qui couvrent le réglage des paramètres principaux (par exemple de puissance d'éclairage et de temps, angle FRBR), l'acquisition et l'analyse des données.
Microscopie seule molécule offre la possibilité unique d'étudier le comportement des protéines au sein de leur environnement cellulaire natif. L'imagerie moléculaire devient donc de plus en plus attrayant pour un large communauté scientifique, encore beaucoup de scientifiques de la vie encore détourner de l'investissement initial dans la technologie et de l'expertise. Le principal avantage résultant de l'assemblage de son propre système d'imagerie est qu'il peut être facilement ajustée aux besoins spécifiques de chacun.
Comme l'a suggéré ici, un non-FRBR faisceau d'excitation peut être facilement mis en œuvre dans plus d'un chemin de lumière de la FRBR existante, si la photo-blanchiment rapide et défini (ou -Activation) de fluorophores et les ligands est souhaitée, par exemple lors de FRAP ou ligands expériences uncaging 14 . L'introduction d'un diviseur de faisceau d'émission permet l'enregistrement simultané d'au moins deux et, dans certains cas jusqu'à quatre canaux fluorescents. La liste des extensions est par essence limitée uniquement parsa propre imagination.
Par exemple, la mise en oeuvre d'une roue de filtre motorisée d'émission dans la voie d'émission permet une commutation rapide entre un maximum de dix chaînes fluorescents différents. En combinant deux roues à filtres d'émission motorisés (équipés chacun de 10 fentes de filtrage) en série, jusqu'à 18 canaux fluorescents pouvant être lu. Imagerie basée sur la FRBR-peut être complété par des mesures de mobilisation du calcium et des réflexions perturbatrices Microscopie (IRM) après intégration d'un chemin de la lampe d'excitation Xénon ou Mercury. IRM est la méthode de choix pour visualiser la mesure dans laquelle les cellules sont attachés à la surface du verre ou un SLB et peuvent donc fournir des informations critiques lors de l'interprétation des données d'imagerie à base de la FRBR. L'établissement d'un faisceau d'excitation élargie à l'aide d'un miroir dichroïque et un laser simples supplémentaire de 405 nm permet la réalisation microscopie photoactivation de localisation (PALM) ou stochastique de reconstruction microscopie optique (STORM), à savoir deux superresolutméthodologies d'ions avec une précision de positionnement inférieure à la limite de diffraction de la lumière visible 15,16.
Cependant, le succès expérimental est non seulement une question de matériel approprié. Pour profiter pleinement de l'imagerie basée FRBR-bruit réduit, les cellules doivent prendre contact pour une surface de façon à ne pas imposer des contraintes sur la surface de la cellule ou qui interfère avec la physiologie de leur membrane plasmique. SLBS fonctionnalisés avec des protéines appropriées pour l'adhésion cellulaire dépassent bien adapté à cet effet, car tous les ligands SLB-embarqués sont latéralement mobile et ajuster leur position latérale dans la bicouche en réponse au récepteur dynamique de liaison et de ségrégation.
Pour fabriquer SLBS de façon reproductible, il est préférable de commencer avec les VUS de haute pureté. Comme décrit ici, il est donc essentiel d'éliminer les vésicules multilamellaires, qui sont également produits au cours de la sonication, en deux étapes d'ultracentrifugation i que ceux-cinterfere avec la formation de SLBS contiguës comportant une grande fluidité. SLBS de forme de haute qualité que sur des surfaces verre propre. Une fois les lames de verre nettoyés doivent être utilisées immédiatement ou stockées dans le vide. Surtout, SLBS ne doivent jamais être exposés à l'air car cela entraînerait leur rupture. SLB laver implique, comme le montre, le tampon de rinçage à l'utilisation d'une pipette sérologique, car cela est non seulement une procédure sauver, mais aussi de gagner du temps.
Pendant la récolte et la purification des protéines résidentes SLB l'utilisation de détergents devrait être évitée. En effet détergent permettra de réduire considérablement la mobilité de la protéine, même lorsqu'il est présent en quantités infimes. Pour contourner la nécessité pour le détergent tous ensemble, l'expression soluble de ligands tag équipée polyhistidine sécrétée est recommandé dans les cellules de mammifères ou d'insectes. Si le repliement des corps d'inclusion de E. coli est nécessaire, la prudence doit être appliqué pour éliminer les détergents efficacement des corps d'inclusion avant leur chômage et de repliement.
Un avantage majeur de l'emploi SLBS résultats de leur nature modulaire et reconstitutive, ce qui permet spécifiquement à disséquer le rôle d'une interaction récepteur-ligand donné pour l'activation des cellules et l'adhésion cellulaire. À cet égard, il est important de mentionner que DGS NTA-Ni devrait être présent à 10% dans le SLB afin d'empêcher les protéines en compétition pour les sites de liaison NTA-NI. Quand on emploie SLBS hébergeant seulement 1% ou 2% DGS NTA-Ni, une réduction de l'association des espèces de protéines de polyhistidine marqués donné peut être remarqué, en particulier en cas de co-incubation de quantités d'une deuxième espèce de protéine de polyhistidine étiqueté croissante (non publié observation). Ce phénomène est pas observée lorsque l'on travaille avec SLBS comportant 10% DGS NTA-Ni.
Bien que nous ayons jamais observé la liaison non spécifique de toute protéine polyhistidine étiqueté testé pour SLBS contenant DGS NTA-Ni, cette possibilité devrait être testé lors de l'introduction d'une protéine pour la première fois,À cette fin, nous recommandons l'utilisation de SLBS dépourvues de DGS NTA-Ni (la protéine ne devrait pas lier). Deuxièmement, lorsque vous utilisez un contenant SLB DGS NTA-Ni, la protéine doit se détacher complètement après le lavage du SLB avec du PBS contenant 300 mM d'imidazole.
Un autre avantage important d'employer SLBS est que les interactions transitoires et les événements de signalisation peuvent être surveillées avec une meilleure résolution spatio-temporelle 17-19. Ceci est au moins en partie à cause d'un processus de liaison en trois dimensions est essentiellement réduite à deux dimensions d'imagerie, en particulier lors de l'enregistrement en mode FRBR bruit atténué. L'utilisation de SLBS est compatible avec la détection du signal de molécule unique, une condition préalable pour la microscopie de photo-activé localisation (PALM) ou stochastique microscopie de reconstruction optique (Storm), c.-à-microscopie superrésolution avec une résolution inférieure à la limite de diffraction 15,16. Ces modalités d'imagerie spéciales permettent seule molécule Förster Resonance Energy Traexpériences nsfer conçus pour visualiser les interactions protéine-protéine individuelles dans un environnement synaptique 20. Cette approche est expliquée en détail dans une publication JoVE appelé 21 "mesure de la liaison en utilisant un test basé sur la microscopie FRET-TCR-pMHC".
Lors de l'interprétation des expériences à base de SLB, il faut toujours garder à l'esprit que toutes les propriétés d'une membrane plasmique d'une cellule vivante sont présentés par SLBS, et que quelques-unes des qualités manquantes pourrait affecter la physiologie sous enquête. Après tout, les protéines SLB-intégrés sont librement diffusent et non organisés en microdomaines membranaires comme la plupart de leurs homologues cellulaires sont 5,6,22. Feuilles de membrane de plasma immobilisée provenant de cellules adhérentes, qui conservent l'architecture de la membrane plasmique de cellules vivantes dans une certaine mesure, ont été avec succès employée pour étudier l'absorption d'antigènes de membrane-embedded par les lymphocytes B 23. Toutefois, même une tellemembranes ne pas interagir avec un cytosquelette très dynamique et disposent d'aucune marge de manœuvre car ils sont pris en charge par une surface de verre rigide. Compte tenu de ces divergences, il existe clairement un besoin pour SLBS ingénierie, qui offrent des moyens de compartimenter protéines dans un mode défini et qui sont pris en charge par des surfaces de flexibilité réglable ou par des surfaces qui changent leur rigidité en réponse à des impulsions lumineuses appliquées localement.
The authors have nothing to disclose.
MA a été soutenue par une bourse de Schrödinger du Fonds scientifique autrichien (FWF, J3086-B11) et remercie la Max-Planck-Society for soutien financier et administratif. GS a été soutenu par le Fonds Science et technologie de Vienne (WWTF, LS13-030). JH a été soutenu par le Fonds Science et technologie de Vienne (WWTF, LS14-031).
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |