Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
それらの作用モードは、多くの場合、従来の生化学的手法により検出し、評価することが困難な低親和性相互作用によって定義されているので、膜タンパク質は、それらの細胞の機能を果たすするメカニズムを理解することは、多くの場合、困難な作業になることができます。膜タンパク質は、さらに、非常に特異的な膜ドメイン5,6に富むまたは原則としてそれらの生物活性を変化させることができる7動的な高次構造を形成することができます。
非侵襲的なレーザ支援単一分子蛍光顕微鏡は、このように複雑な細胞環境におけるタンパク質の挙動を研究するために選択した方法論となっています。これらは、原理的にノイズ低減全反射(TIRF)モードで監視することができ、これは、細胞膜で起こる生化学的プロセスのために特に当てはまります。ここではサンプルの照明がガラスのsuに近接した200nmの薄いスライスまでに制限されていますまた、蛍光シグナル強度8,9の実質的な増加に起因エバネッセント励起光の特性は、細胞のバックグラウンドにおける有意な損失をもたらすとrface。単一分子の検出に高い位置分解能と時間分解能を目指すと、両方の側面が重要です。
平面のSLBは、TIRF顕微鏡でのみ互換性がありません。適切なリガンドで官能とき、彼らはまた、彼らは免疫細胞または他の細胞で発生するように、細胞 – 細胞認識の分子動力学を研究への直接アクセスを提供します。これらは、単に、そのような細胞は、導通試験は、単一分子追跡または単一分子ベースの超解像に関与するときに非常に望ましいTIRF照明で画像化することができるように、スライドガラスに十分に近い運動性、そうでなければ、非接着細胞を配置するために利用することができます。この目的を達成するために、タンパク質は非常にモバイルSLBにロードする必要があります。使用のLiの固有の利点 PIDは、すべてのタンパク質のない非特異的結合がないことです。また、SLBのは、自分自身を癒すために、固有の能力を持つ二次元液体とみなすことができます。ガラス支持体中に凹凸がある程度まで補償されます。ステップバイステップの手順は、目的のタンパク質と高度に荷電した移動体の二重層を発生させるために設けられています。平面のSLBの形成は、主成分(90-99%)、合成および官能化脂質1,2- dioleoyl-として1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)を含有する、記載されていますSN -glycero-3 – {[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル}ニッケル塩(DGS NTA-Ni)の少量(1〜10%)です。 POPCは、一飽和脂肪酸と一つのモノ不飽和脂肪酸を運び、さらに室温で高流動性の脂質二重層を形成します。 DGS NTA-Niは、ポリヒスチジン尾部への頭部基と結合すると、選択したポリヒスチジンタグ化タンパク質( 図1)のアンカーとして機能します。
">重要なことは、顕微鏡のハードウェアが提供された情報と光学系とレーザー物理学のいくつかの基本的な知識が、任意の生物学者は、単一分子イメージングのセットアップを構築することができる必要があります。以下で説明されている周辺機器の番号を含める必要があります。サンプルの励起は、理想的であるべきですこの計画は、偽の光と細胞の自家蛍光9からそうでない場合は、得られた過剰なバックグラウンドを減少させるように全反射(全反射)モードで倒立顕微鏡で行った。このために、特別なTIRF対応の目的(下記参照)とレーザー照射が必要とされています。いくつかの実験は、ミリ秒の範囲内の照明時間を必要と矢継ぎ早に操作します。点灯時間を節約するために、または、2つ以上のスペクトルチャネルに放出された光を分割することがしばしば有用である反復的な照明による不要な漂白を避けるために。これは、同時読み出しを可能にしますconduc重要な要因となることができる2つ以上の発光プロファイルのフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)を含むティン実験。ここで、単一の励起光パルスから生じる発光はFRETドナーから、および(増感発光のような)をFRETアクセプターの両方を記録することができます。カメラは、照射時間の間に、単一の蛍光色素分子を可視化するために十分に低いバックグラウンドで十分な光子をキャプチャする必要があります。コンピュータソフトウェアは、励起シャットと画像取得を同期させるために、最大タスクになる必要があります。総合的な概要は以下および図2に示されています:TIRF対応の目的は、対物系のTIRF照明用対物レンズの開口数(NA)は、に等しいか、または標準的なガラススライドを使用して1.4より大きくなければならない(N = 1.515)9。倍率は150倍に60倍の間の範囲であることができます。目的は、クロマチック異なる蛍光体を撮像する際共焦点を可能にするために修正する必要があります。
レーザー:使用可能なレーザー光をあてるの数Rオプションが大幅に過去数年にわたって増加しています。現代の電子的に変調連続波ダイオードレーザは、コスト効率的であり、前例のない周波数と速度で動作させることができます。より高価なガスイオンレーザーは、レーザービームの品質に優れるが、外部シャット(下記参照)、多くの場合、広範囲(水)冷却を必要とします。
励起シャッター:音響光学変調器(AOM)が急速に連続10で高速シャットを可能にします。タイトな機械式シャッター付きのAOMの組み合わせを遮断することをお勧めします。このように原因連続光暴露にAOMの大規模な加熱が回避され、オフの位置にAOMから漏れる光が相殺されます。
レンズは、レーザビームを広げると、対物レンズの後焦点面にそれらを集中するために使用されます。このように、励起光は、TIRF照明のために必要とされる平行光束( 図3)のような目的を残しサンプル。目的の周囲に中心から後焦点面内に焦点を移動する機能である試料でのレーザスポット( 図3)、の位置ビームが目的を離れる角度を変更しませんが、全体的なビーム形状の。 TIRF照明は、対物レンズの焦点面内にレーザの焦点を変換する潜望鏡として機能するミラーのセットを使用して調整することができる臨界角で行なわれます。レンズは、色彩補正されるべきであり、二、三のレンズのセットで使用することができます。三レンズ系は、対物レンズ( 図4)の後側焦点面に幅広ビームを集束するために、レーザビーム(したがって、試料に照明スポット)と第3レンズを広げるための望遠鏡として機能する2枚のレンズで構成されています。両方の機能(望遠鏡及びフォーカシング)はまた、唯一の二つのレンズの組み合わせによって達成することができる( 図4参照)。
<p class="「jove_contentは""> ミラーは、レーザ光 の損失を回避するために、少なくとも95%の反射率であるべきです。このような配置は、正確にレーザビームの任意の角度と位置を調整するのに十分であるように、各ビーム調整のための二つのミラーの組は、通常適用されます。二色オーバーレイは反射し、異なる指定された波長の光を透過し、2つのレーザビームを重畳または分割するために使用されます。
Polychroicフィルタは、ダイクロイックフィルタよりも複雑であり、入ってくる励起光を反射し、試料からの出射光を出射する送信するために必要とされます。それらは、対物レンズと顕微鏡管レンズとの間にフィルタキューブ内に配置されています。
フィルターをクリーンアップ :レーザーemploye d個のレーザーの種類に応じて、それはレーザーを離れた直後に、レーザビームの中に配置する必要があり、狭い伝送帯域幅を有するフィルタをクリーンアップします。
ノッチフィルタ効果的に狭い帯域幅を有するレーザー光を吸収し、他のすべての光を透過するように設計されています。それらは、任意のスプリアスのレーザー励起光をフィルタリングするための放射経路内に配置されています。しかし、ノッチフィルタは、0°の入射角でのみ動作します。ノッチフィルタの帯域幅は非常にシャープである場合は、別の着信角度が任意のより反映されない場合があります。コリメートされたレーザのレーザ光の遮断には影響しませんが、後方散乱光を効率的にカメラに到達するのを妨げていない可能性があります。
レシオメトリックキセノンまたは水銀アークランプの前に置かれたときに適切なフィルタホイールを備えた電動フィルターホイールを容易に励起および発光経路に配置され、異なる光強度(NDフィルタを搭載した場合)、または蛍光チャネル(の間の単純な切り替えを可能にすることができ発光の蛍光体を選択するためにカルシウムイメージングやカメラの前で)。
50:50キューブビームスプリッターC二つの別々の励起ビーム路にレーザービームを分割するために使用され、また、潜望鏡の前にそれらを結合します。
ビームスプリッター(排出路):物理的なフィルタの変更を必要とせずに高速な画像取得のために、放射ビームをシフト青と赤方偏移チャネルに分割されます。原理的には、ビームスプリッタは、ダイクロイックウェッジまたはミラーのセットと、波長依存性の様式で放出光を分離するダイクロイックミラーを用いることにより構築することができます。 2つの発光フィルタは、放出されたチャネルをクリーンアップするために必要とされます。
空間フィルター:励起ビームの空間フィルタリングは、しばしば低品質のレーザ光 から射出された非平行光線を除去する必要があります。空間フィルタは、両方のレンズの焦点に正確に配置された小さなピンホールを持つ2つのレンズ望遠鏡で構成されています。レーザビームの非平行な部分から得られるこのようスプリアス光を効率的にブロックされた状態になります。蘇TIRFベースの顕微鏡を確立するとき、CHの条件が満たされなければなりません。焦点に位置するのがより困難である小さいピンホールを有する、第1レンズの焦点距離が小さくなると、空間フィルタリングが増加します。レンズ収差による影響を低減するためではなく、単純なレンズを低倍率(10倍または20倍)の高品質と無限遠補正顕微鏡対物レンズを使用することが有利です。
ペリスコープ:潜望鏡セットアップ目的、TIRFイメージングのための前提条件の後焦点面内に集束レーザービームを変換する必要があります。これは、簡単に2つの2インチのミラー、第1のミラーを調整するための並進ステージと顕微鏡( 図5)に広がり、集束励起ビームを反射するように第2のミラーを位置決めするためのポストから構築することができます。
カメラ:裏面照射型電子増倍電荷結合素子(EMCCD)が日常的に使用されています単一分子信号の記録。これは、高い量子効率の高い収集速度、(95%まで)(最大30 MHz)の比較的低ノイズです。 -80℃に冷却すると、熱雑音を低減し、現在利用可能なEMCCDカメラの数によって支持されています。 EMCCD技術の限界は、カメラノイズはカメラ利得の両方と捕獲される信号に線形的に増加することです。これは、sCMOSチップの特別なアーキテクチャにもはるかに高速EMCCDカメラよりも大幅に安価であり、動作科学CMOS(sCMOS)カメラ、の場合ではありません。しかし、CMOS技術に関連する問題は、各画素が異なる検出感度を備えていますので、画像の取得は、まだ、単一分子レベルでの定量的な読み出しをある程度欠いているということです。主に、これは、画素の正規化を介して補償することができるが、この手順は、11自明されるものではありません。我々はまだ再することを躊躇理由はここにあります単一分子顕微鏡のためsCMOSカメラを称賛するが、この技術の急速な発展の観点から、sCMOSカメラはすぐに好みのカメラになるかもしれません。スロースキャンCCDカメラカメラは、すべて一緒に、増幅に関連するノイズや画素の分散を回避し、これらはいわゆる「運動」モードで動作させることができれば最速取得レートをサポートします。このモードでは、関心領域(ROI)を除いて全体のカメラチップは、記憶装置としてのチップ自体を使用することを可能にするれ、マスクされています。 ROIが最初に露出した後、得られた電荷は、画像がさらに露光から保護される画素ラインによりチップ画素ラインのマスクされた領域にシフトされます。マスクされた領域へのROIのすべての行の移動が(サブミリ秒の範囲内で)完了すると、ROI自体が次の露光のための準備ができています。 CCDチップのすべての画素ラインが充電されるまで、このサイクルが繰り返されます。チップはその後著しくのReduでゆっくり読み出され、CED読み出しノイズ。 1000 x 1300ピクセルのチップ上に、例えば、50×50画素の20のROIは、急速に連続して記録することができます。画像が読み出される前に、かなりの時間のために、チップ上に残るので、高品質のマスキングを確実にするために、過度の熱雑音を低減する手段としてのカメラ(例えば、液体窒素を用いて)を冷却することが重要です。いくつかのEMCCDカメラはまた、運動モードをサポートしています。
ソフトウェア:レーザーのタイミング、シャッターのAOMと、カメラの露出だけでなく、適切な画像の保存は、あらゆる成功したイメージング実験に不可欠です。原則的に、多くの定義された操作は、カメラに付属している利用可能なソフトウェアパッケージを用いてプログラムすることができます。市販のソフトウェアパッケージは少し技術的なノウハウを用いて実施することができるハードウェア・ペリフェラル、多数のをサポートしています。
パルス発生、(アナログおよびデジタル出力チャンネル)データ集録(DAQ)ボードとオシロスコープ:パルス発生器であります定義された時間と電圧のパルスにトリガパルスを変換するための優れた選択肢。このようにレーザーを正確に出力するための制御サブミリ秒の範囲のミリ秒でタイムアウトすることができます。アナログ出力とDAQボードは、同じことを達成するため、容易にPCIスロットを介してコンピュータのマザーボードに組み込まれています。パルス継続時間、振幅と周波数をオシロスコープで確認されています。
全体の励起光路のエンクロージャ:空気による対流に全体の励起光路を励起プロファイルの変動を回避するためには、ラボ環境から囲む必要があります。 TIRF顕微鏡を行う際に、この措置は、特に重要です。光学部品は、また、ほこりやレーザー露光から人間の目から保護されます。エンクロージャは、簡単に芸術の供給の店で購入することができます黒のカードボード、からビルドすることができます。
Photobleac後SLB蛍光回復の流動性を測定するために、興(FRAP)測定12が行われます 。 FRAPのために2つの励起ビーム経路が存在する(図3参照)ことが望ましいです。第1のビーム経路は、画像に二層の蛍光を設計されています。これはTIRF構成で、低光強度で行うことができます。それは光軸に沿って目標を残すように、第2のビーム経路は、短いが強烈な漂白剤パルスを可能にすべきであると非TIRFモードで設定する必要があります。円形開口部は、定義されたエッジを完全に丸い漂白プロファイルを投影する( 図8参照 )、励起ビーム経路内に配置することができます。物体面上にこの開口イメージするために、その最適な位置(図3参照 )は、レンズ3の焦点面にあるであろう。開口が少しずれた位置に配置されたときただし、このレンズの長焦点に、十分な品質のアパーチャ像も生成することができます。
Tを行った後彼は生データを適切に分析しなければならない実験を画像化します。いくつかのステップバイステップのプロトコルは、取得したデータを分析し、メイン設定(照射パワーと時間、全反射角)の調整をカバーする、提供されています。
単一分子顕微鏡は、それらの天然の細胞環境内のタンパク質の挙動を研究するユニークな機会を提供します。分子イメージングは、広範な科学界に、したがって、ますます魅力的になり、まだ多くの生命科学者はまだ離れて技術とノウハウの初期投資を敬遠。自分のイメージングシステムの組み立てに起因する主な利点は、それが容易に誰の特定のニーズに合わせることができるということです。
本明細書に示唆されるように、非TIRF励起光が容易に既存のTIRF光路に加えて実施することができ、フルオロフォアおよびリガンドの迅速で定義された光退色(または-活性化)が望まれる場合、例えば実行FRAPまたはリガンドアンケージング実験14 。放射ビームスプリッタの導入は、少なくとも二つの、いくつかのケースでは4つの蛍光チャンネルまでの同時録音が可能になります。拡張子のリストは、本質的にのみによって制限されています自分の想像力。
例えば、放射パスに電動式発光フィルタホイールを実装する最大10個の異なる蛍光チャネル間の高速スイッチングが可能になります。直列に(それぞれ10フィルタスロットを装備した)は、2つの電動発光フィルタホイールを組み合わせる場合、最大18の蛍光チャネルを読み出すことができます。 TIRFベースのイメージングは、キセノンまたは水銀ランプ励起経路の統合後のカルシウム動員の測定値と干渉反射顕微鏡(IRM)で補完することができます。 IRMは、ガラス表面またはSLBに結合している細胞及びTIRFベースの撮像データを解釈するとき、従って、重要な情報を提供することができる程度を視覚化するために選択される方法です。シンプルなダイクロイックミラーを使用すると、光活性化ローカライゼーション顕微鏡(PALM)または確率的光学再構築顕微鏡(STORM)を実施できますnmで405の追加のレーザー、すなわち2 superresolutに広がった励起ビームの確立可視光15,16の回折限界以下の位置精度でイオン方法。
しかし、実験の成功だけでなく、適切なハードウェアの問題です。ノイズ低減TIRFベースのイメージングを最大限に活用するために、細胞は、細胞表面上の制約を課すか、それはその形質膜の生理機能に干渉しないやり方で表面に接触する必要があります。すべてのSLB-埋め込みリガンドは、横方向に、移動され、結合および分離ダイナミクスを受容体に応答して、二重層内での横方向の位置を調整するため、細胞接着のための適切なタンパク質で官能のSLBは、この目的によく適している超えます。
再現可能な方法でのSLBを製造するためには、高純度のSUV車でスタートするのがベストです。本明細書に記載されるように、これらのIのような2つの超遠心分離工程においても、超音波処理の間に生成された多重膜小胞を除去することが重要です高い流動性を特色に連続するのSLBの形成とnterfere。唯一のきれいなガラス表面上に高品質のフォームののSLB。一度洗浄したガラススライドは、直ちに使用または真空に格納する必要があります。これは彼らの混乱につながるとして重要なのは、SLBのは、空気にさらされてはなりません。 SLBの洗浄はこの保存はなく、時間を節約する手順だけではないように、バッファは血清学的ピペットを使用してすすぎ、示されるように、関与します。
SLB常駐タンパク質の回収および精製中に界面活性剤の使用は避けるべきです。ときに微量に存在する界面活性剤があっても有意にタンパク質の移動性が低下するからです。すべて一緒に洗剤の必要性を回避するために、分泌されたポリヒスチジンタグを搭載したリガンドの可溶性発現は、哺乳動物細胞や昆虫細胞で推奨されています。大腸菌封入体からのリフォールディングが必要な場合は、注意が彼らの不およびリフォールディングの前に封入体から効果的に界面活性剤を除去するために適用する必要があります。
具体的には、細胞活性化および細胞接着のために与えられた受容体 – リガンド相互作用の役割を分析することができ、それらのモジュール式reconstitutive自然からのSLB結果を採用する主な利点は、。これに関して、DGS NTA-NiはNTA-NI結合部位について競合するタンパク質を防止するために、SLB内の10%に存在するべきであることを言及することは重要です。わずか1%または2%のDGS NTA-Ni系、与えられたポリヒスチジンタグ融合タンパク質種は未発表(第2ポリヒスチジンタグ付きタンパク質種の量の増加を同時インキュベートする場合は特に、気づいたことができるの関連の減少を保有するSLBを使用する場合観察)。 10%DGS NTA-Ni系を搭載したのSLBで作業する場合、この現象は見られません。
我々はDGS NTA-Niを含むのSLBに試験したいずれのポリヒスチジンタグ融合タンパク質の非特異的結合を観察したことがないものの、初めてのタンパク質を導入する際に、この可能性をテストする必要があり、この目的のために、我々はDGS NTA-Ni系(タンパク質が結合してはならない)を欠いているのSLBの使用をお勧めします。 DGS NTA-Niを含むSLBを使用した場合第二に、タンパク質は、PBSを300 mMイミダゾールを含有するSLBを洗浄した後、完全にオフに来る必要があります。
SLBを採用する別の重要な利点は、一時的な相互作用およびシグナル伝達事象を高める時空間解像度17-19で監視することができるということです。三次元的な結合プロセスは、本質的に2つの撮像寸法に縮小されるので、これはノイズ弱毒TIRFモードで記録する場合は特に、少なくとも部分的にあります。 SLBを使用すると、単一分子信号検出、光活性化ローカライゼーション顕微鏡(PALM)または確率的光学再構築顕微鏡(STORM)の前提条件と、回折限界15,16以下の解像度を持つ、すなわち超解像顕微鏡と互換性があります。これらの特別なイメージングモダリティは、単一分子フェルスター共鳴エネルギートラを有効にシナプス環境20内の個々のタンパク質-タンパク質相互作用を可視化するために設計さnsfer実験。このアプローチは、21「FRETベースの顕微鏡アッセイを使用して結合TCR-のpMHCの測定」と呼ばれるJoveの出版にかなり詳細に説明されています。
SLBベースの実験を解釈すると1は常に生細胞の形質膜のないすべてのプロパティは、SLBのことで紹介されています心に留めておくべきであり、欠けている資質のいくつかは調査中の生理機能に影響を与える可能性があります。結局、SLB-埋め込 まれたタンパク質は、自由に拡散し、その細胞カウンターパートのほとんどは5,6,22であるため膜マイクロドメインに組織化されていません。ある程度の生細胞の細胞膜構造を節約する接着性細胞に由来する固定化された原形質膜シートは、正常Bリンパ球23によって膜に埋め込 まれた抗原の取り込みを研究するために使用されてきました。しかし、このような膜は、非常に動的な細胞骨格と相互作用し、それらは硬質ガラス面でサポートされているとして何の柔軟性を備えていません。これらの不一致を考慮して調整可能な柔軟性の面で、または局所的に適用される光パルスに応じてその剛性を変更する面でサポートされている定義された方法でタンパク質を区分するための手段を提供し、エンジニアリングのSLBの必要性が明らかに存在します。
The authors have nothing to disclose.
MAは行財政支援のためのオーストリア科学基金(FWF、J3086-B11)と感謝のシュレーディンガーの交わりマックスプランク協会によってサポートされていました。 GSは、ウィーン科学技術基金(WWTF、LS13-030)によってサポートされていました。 JHは、ウィーン科学技術基金(WWTF、LS14-031)によってサポートされていました。
#1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
lens | Thorlabs, Newport | – | |
DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
periscope | Thorlabs | RS99/M | |
picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
vacuum pump | VWR | 181-0248 |