Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.
Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of >10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.
Per virologi di RNA, l'avvento della tecnologia del DNA ricombinante alla fine del 1970 ha permesso di convertire i genomi di RNA virale in cloni di cDNA, che potrebbero poi essere propagati come plasmidi nei batteri per la manipolazione genetica dei virus RNA. 1 Il primo virus RNA per essere molecolarmente clonato era batteriofago Qβ, un virus a RNA positivo filamento che infetta Escherichia coli. Un plasmide contenente una copia completa del cDNA dell'RNA genomico Qβ all'origine infettive fagi Qβ quando introdotto in E. coli. 2 Poco dopo, questa tecnica è stata applicata a poliovirus, virus RNA positivo filamento di esseri umani e animali. Un plasmide recante un full-length cDNA dell'RNA genomico poliovirus è infettivo quando trasfettato in cellule di mammifero e in grado di produrre virioni infettivi 3 In questo approccio "DNA-lanciato", i cDNA clonati andrebbe trascritto intracellulare di avviare la replicazione dell'RNA virale.;Tuttavia, non è chiaro come si inizia la trascrizione e come le trascrizioni vengono elaborati nella sequenza corretta virale. Questa preoccupazione ha portato allo sviluppo di un'alternativa "RNA-lanciato" approccio, in cui una copia completa del cDNA dell'RNA genoma virale viene clonato sotto promotore riconosciuto da un E. coli o fago RNA polimerasi per la produzione di RNA sintetici di vitro con definito 5 'e 3' termini, che subiscono il ciclo completo di replicazione virale quando introdotto in cellule ospiti. 4,5 Il primo successo con questo approccio è stato segnalato per brome mosaic virus , 6,7 un virus RNA positivo filamento di piante. Da allora, l'approccio RNA lanciato è stato sviluppato per una vasta gamma di virus a RNA positivo filamento, tra cui calicivirus, alphaviruses, flavivirus, arteriviruses e coronavirus. 1,4,5,8
Sia il DNA e RNA-lanciato sistemi genetica inversa, la costruzione di un Full lunghezza clone di cDNA è la chiave per generare DNA infettivo o RNA di virus a RNA positivo filamento, ma diventa una sfida considerevole tecnica come la dimensione degli aumenti genoma virale. 9-17 In particolare, una grande genoma RNA di ~ 10 -32 kb presenta tre principali ostacoli alla clonazione di un cDNA funzionale full-length. 18 La prima difficoltà è la sintesi di un fedele cDNA copiano, poiché la fedeltà di RT-PCR è inversamente proporzionale alla lunghezza del RNA virale. Il secondo ostacolo è la presenza di sequenze potenzialmente tossici, poiché le molecole di RNA lunghi sono più probabile che contengono sequenze inaspettati capaci di rendere il frammento di cDNA in plasmidi instabili di E. coli. Il terzo e più importante problema è la disponibilità di un vettore adatto, dal momento che è difficile trovare un vettore di clonazione che può alloggiare un inserto di cDNA virale> 10 kb. Nel corso degli ultimi tre decenni, queste barriere sono state superate da alcuni progressi in enzimologia, la metodologia, und vectorology. 1,4,5,8 Di questi, lo sviluppo più promettente e innovativo è la clonazione di grandi virus a RNA positivo filamento come infettive cromosomi batterici artificiali (BAC). Il vettore BAC è un plasmide a basso copia clonazione (1-2 copie / cella) in base alla E. coli plasmide f, con una dimensione media di DNA dell'inserto ~ 120-350 kb 19-21 Un frammento di DNA viene inserito nel vettore BAC in modo simile alla clonazione nei vettori di clonazione generali.; le conseguenti cloni BAC sono stabili per molte generazioni a E. coli. 22,23 ad oggi, la tecnologia BAC è stata utilizzata per creare cloni di cDNA infettivi per> 10 membri di tre positivo-strand famiglie di virus RNA, cioè flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 e Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32
Utilizzando virus dell'encefalite giapponese (JEV), come esempio, il presente lavoro riporta le procedure dettagliate che possono essereutilizzato per costruire un full-length BAC infettiva geneticamente stabile per una varietà di virus RNA positivo filamento. ICE è un flavivirus zoonotici 33 che si trasmette nella natura tra gli uccelli, maiali e altri host vertebrati da zanzare vettori. 34,35 Nell'uomo, l'infezione può causare il ICE spesso fatale malattia neurologica grave encefalite giapponese (JE), 36 che si verifica in Asia e parti del Pacifico occidentale, 37,38 con un'incidenza annuale stimata di ~ 50,000-175,000 casi clinici. 39,40 Il genoma di ICE è un ~ 11 kb, a singolo filamento, positivo-senso molecola di RNA ed è composto da un unico open reading frame (ORF) affiancato da due regioni non codificanti (NCR) al 5 'e 3' termina. 41,42 L'ORF codifica una poliproteina che viene scisso dagli host e proteasi virali per generare 10 singole proteine, designato C, PRM E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5 nella N in direzione C-terminale. 34,43,44 inoltre, una esotto forma di Xtended NS1 (NS1 ') si esprime con -1 frameshifting ribosomiale ai codoni 8-9 di NS2A. 45,46 Di queste 11 proteine, le tre proteine strutturali (C, PRM, ed E) sono essenziali per la formazione di malattie infettive virioni, 47,48 e le restanti otto proteine non strutturali (NS1 a NS5, e NS1 ') sono fondamentali per la replicazione virale RNA, assemblea 49-51 particella, 52-56 e innata immunità evasione. 57-59 Sia il 5' e 3 'NCR contengono conservati sequenze primarie e strutture forma RNA secondari e / o terziari, 60-62 che sono importanti per modulare la replicazione RNA virale. 63,64
Questo protocollo descrive gli strumenti, i metodi e le strategie per la generazione di un full-length BAC infettiva di ICE SA 14 -14-2. 28 Questo clone BAC funzionale contiene una copia completa del cDNA dell'RNA genomico ICE, 65 che è comprendeva da un promotore per la polimerasi SP6 RNA a montedel virale 5'-end e un sito di restrizione Xba I unica valle del 3'-end virale per la trascrizione in vitro di dilavamento. Questa tecnologia BAC è applicabile alla costruzione di un clone molecolare di cDNA completamente funzionale per una vasta gamma di virus a RNA positivo-strand.
Il protocollo attuale è stata utilizzata con successo per generare full-length cDNA cloni infettive, per due diversi ceppi (CNU / LP2 27 e SA 14 -14-2 28) di ICE, un flavivirus cui cDNA funzionale ha dimostrato di essere di per sé difficile da costruire e propagare causa della tossicità cellula ospite e l'instabilità genetica del cDNA clonato 8,74-76 Questo protocollo prevede tre componenti principali:. prime, massimizzando la sintesi / amplificazione del cDNA una copia fedele del RNA virale con alta fedeltà transcrittasi inversa / DNA polimerasi; secondo, la clonazione il PRM-E codificanti regione virale contenente sequenze tossiche (dati non pubblicati) 74,77,78 in un bassissimo copia numero vettore BAC del cDNA iniziale subcloning ai full-length fasi di montaggio cDNA finali; e in terzo luogo, utilizzando un tasso alcolemico di clonazione vettore che può ospitare un DNA estraneo con una dimensione media di 120-350 kb, 19-21 che tollera apparentemente più grande inse DNArts di quanto non facciano altri vettori di clonazione. Questo approccio clonazione sarà generalmente applicabile a molti altri virus a RNA positivi filamento, in particolare quelli con una grande genoma RNA del ~ 10 a 32 kb. Generazione di un clone di cDNA infettiva è un passo fondamentale nello sviluppo di un sistema di genetica inversa per virus a RNA, soprattutto per i virus a RNA positivi a filo, perché il suo genoma agisce come mRNA virale che si traduce in proteine dai ribosomi della cellula ospite. Così, la replicazione virale può essere iniziato con l'introduzione di un genoma lunghezza RNA molecola di cDNA derivato in una cellula ospite suscettibile. La disponibilità di un clone di infettiva ICE cDNA, quando combinato con la tecnologia del DNA ricombinante, ha aumentato la nostra comprensione dei vari aspetti del ciclo di vita virale a livello molecolare, come ad esempio l'espressione genica 73,79 e replicazione del genoma. 63,64 Inoltre, un full-length ICE clone di cDNA ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per lo sviluppo di vaccini antivirali 28 e vettori di trasferimento genico. <sup> 80,81
Come per tutti i virus RNA positivi fili, ci sono più passaggi critici nella costruzione di un cDNA funzionale affidabile per ICE da cui RNA altamente infettivi possono essere sintetizzate in vitro. Idealmente, la sequenza di RNA sintetici trascritti da un clone della intera lunghezza cDNA dovrebbe essere identica a quella del RNA genomico virale, in particolare i 5'- e 3'-terminale sequenze che sono necessari per l'inizio della replicazione virale RNA . 60-62 Nel protocollo corrente, l'autentica e 5'-3'-estremità erano assicurati mettendo la sequenza del promotore SP6 monte della prima adenina nucleotide del genoma virale e il posizionamento di un sito di restrizione Xba I artificiale unica valle dell'ultimo timina nucleotide del genoma virale, rispettivamente. Capped RNA sintetici con l'autentico 5 'e 3' estremità sono state prodotte dalla trascrizione run-off di un Xba I-linearizzato e MBN trattati cDNA template usando SP6 RNA polimerasi innescato con il m 7 G (5 ') ppp (5') Un analogo cap. Questo protocollo può essere modificato in vari modi. Per la trascrizione in vitro, un'altra RNA batteriofago polimerasi (ad esempio, T3 o T7) può essere utilizzato in combinazione con la sua sequenza promotore ben definita. 27 Come sito scolo, un sito di restrizione differente può essere utilizzata se non è presente in il genoma virale e se l'RNA sintetico del cDNA linearizzato termina con l'autentico 3 '. L'importanza della sequenza nucleotidica 3'-end è stata dimostrata da una diminuzione ~ 10 volte in RNA infettività quando un RNA sintetico contiene tre o quattro nucleotidi virus non correlato alla sua 'estremità 3. 27 In una reazione di trascrizione in vitro, sia la m 7 G (5 ') ppp (5') A e m 7 G (5 ') ppp (5') G tappo analogico può essere utilizzato altrettanto bene, anche se queste ultime posti un estraneo G nucleotide supplementare monte del virale 5 '-end, ma cheInoltre non altera l'infettività o la replica di RNA sintetico. 27 Inoltre, la rimozione del cDNA da RNA trascritti di DNasi I digestione non è necessaria per le prove RNA infettività, poiché il modello cDNA sé non è infettiva. 27
La tecnologia BAC è stata ora applicata alla costruzione di cloni di cDNA infettivi per una manciata di virus a RNA positivo filamento, vale a dire, due JEVs, CNU / LP2 27 e SA 14 -14-2 28 (dimensione del genoma, ~ 11 kb); due virus dengue, BR / 90 26 e NGC 29 (~ 11 kb); il virus della diarrea bovina virale, SD1 (~ 12 kb); 25 due classici virus della febbre suina, C e Paderborn (~ 12 kb); 24 il virus della malattia di confine, Gifhorn (~ 12 Kb); 24 il suino virus sindrome riproduttiva e respiratoria , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 il virus gastroenterite trasmissibile, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 il felino virus della peritonite infettiva,DF-2 (~ 29 kb), 32 la grave sindrome acuta da coronavirus respiratorio, Urbani (~ 30 kb), 9 Medio Oriente sindrome respiratoria coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 e coronavirus umano, OC43 (~ 31 kb) 31 Il principale vantaggio di utilizzare BAC per la costruzione di cDNA è l'elevata stabilità genetica delle grandi, 1 o 2 copie plasmidi BAC.; tuttavia, la natura intrinseca del suo numero estremamente basso di copia è anche un grande svantaggio, a causa delle basse rese di DNA BAC e la conseguente riduzione della purezza del DNA BAC rispetto ospitare DNA cromosomico. Nel protocollo attuale, il rendimento del DNA BAC è massimizzata da una crescente E. coli DH10B trasformato con il contagioso BAC PBAC / SA 14 -14-2 in un mezzo ricco di sostanze nutritive, 2xYT. Nonostante questo sforzo, il rendimento medio è solo ~ 15 mg di DNA BAC da 500 ml di brodo 2xYT. Inoltre, la purezza del DNA BAC è meglio realizzato utilizzando CsCl-EtBr centrifugazione in gradiente di densità per la purificazione, Piuttosto che la colonna basata isolamento plasmide comunemente usato. Tuttavia, è importante tenere presente che la E. BAC trasformati coli non deve invadere perché potrebbe mettere a repentaglio la stabilità genetica del cDNA clonato, e una maggiore crescita non necessariamente portare a maggiori rendimenti o superiore purezza BAC DNA.
Il protocollo qui descritto è ottimizzato, efficiente, e il metodo semplificato per la costruzione e la propagazione di un full-length geneticamente stabile clone cDNA infettiva come BAC per ICE, una procedura volta pensò praticamente impossibile. Questa stessa strategia di clonazione può anche essere applicato a molti altri virus a RNA positivo filamento. In generale, cloni di cDNA infettivi ci permettono di introdurre una varietà di mutazioni (ad esempio, delezioni, inserzioni e mutazioni puntiformi) in un RNA genoma virale per studiare le loro funzioni biologiche nella replicazione virale e la patogenesi. Questo sistema di genetica inversa basata cDNA-consente di sviluppare e TESt vaccino e candidati terapeutici mirati un fattore di virulenza (s) di un particolare virus RNA positivo filamento di interesse. Inoltre, questa tecnologia cDNA infettiva può essere utilizzato anche come un vettore virale, capace di esprimere un gene estraneo (s) di interesse per molte applicazioni nella ricerca biomedica.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.
1. Molecular Cloning | |||
2xYT Broth | Sigma-Aldrich | Y2377 | |
[3H]UTP | PerkinElmer | NET380250UC | Radioactive |
50-mL Tube | Thermo Scientific (Nalgene) | 3114-0050 | |
250-mL Bottle | Beckman Coulter | 356011 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Agarose (Low Melting Point) | Life Technologies (Invitrogen) | 16520-100 | |
AvaI | New England BioLabs | R0152S | |
AvrII | New England BioLabs | R0174S | |
BamHI | New England BioLabs | R0136S | |
BsiWI | New England BioLabs | R0553S | |
BsrGI | New England BioLabs | R0575S | |
Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
Cap Analog [m7G(5ʹ)ppp(5ʹ)A] | New England BioLabs | S1405S | |
Cesium Chloride | Fisher Scientific | BP1595-1 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Carcinogenic |
DE-81 Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 3658-023 | |
dNTP mix | Life Technologies (Invitrogen) | 18427-088 | |
E. coli DH10B | Life Technologies (Invitrogen) | 18297-010 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | Toxic and highly mutagenic |
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-26 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | Irritating |
Glucose | Sigma-Aldrich | G5400 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | |
High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491S | |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9392 | Flammable |
Isopropanol | Amresco | 0918 | Flammable |
LB Broth | Life Technologies (Invitrogen) | 12795-027 | |
Lithium Chloride | Sigma-Aldrich | L9650 | |
Lysozyme | Amresco | 0663 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
M-MLV Reverse Transcriptase | Life Technologies (Invitrogen) | 18080-044 | |
Mung Bean Nuclease | New England BioLabs | M0250S | |
Needle (18G, 20G) | BD | 305196, 305175 | Biohazardous (Sharps waste) |
NotI | New England BioLabs | R0189S | |
Oligonucleotide | Integrated DNA Technologies | Custom Oligonucleotide Synthesis | |
PacI | New England BioLabs | R0547S | |
pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Phenol (Buffer-Saturated) | Life Technologies (Invitrogen) | 15513-039 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Life Technologies (Invitrogen) | 15593-031 | Toxic and highly corrosive |
Phenol:Guanidine Isothiocyanate | Life Technologies (Ambion) | 10296-010 | Toxic, corrosive, and irritating |
Pme I | New England BioLabs | R0560S | |
Potassium Acetate | Amresco | 0698 | |
RNase Inhibitor | Life Technologies (Invitrogen) | 10777-019 | |
rNTP Set | GE Healthcare Life Sciences | 27-2025-01 | |
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm) | Beckman Coulter | 342413 | |
SfiI | New England BioLabs | R0123S | |
Sma I | New England BioLabs | R0141S | |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | 0227 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
SP6 RNA Polymerase | New England BioLabs | M0207S | |
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) | Life Technologies (Invitrogen) | K2100-11 | |
Syringe | HSW NORM-JECT | 4200.000V0 | |
T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
Tris | Amresco | 0826 | |
tRNA (yeast) | Life Technologies (Invitrogen) | 15401-011 | |
XbaI | New England BioLabs | R0145S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Cell Culture | |||
Alpha Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 12561-049 | |
Conical Tube (50 mL) | VWR | 21008-242 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C0775 | |
Culture Dish (150 mm) | TPP | 93150 | |
Cuvette (2-mm Gap) | Harvard Apparatus | 450125 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies (Gibco) | 16000-044 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Toxic and carcinogenic |
Glutamine | Life Technologies (Gibco) | 25030-081 | |
Minimal Essential Medium | Life Technologies (Gibco) | 61100-061 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies (Gibco) | 15070-063 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Six-Well Plate | TPP | 92006 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S3264 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies (Gibco) | 25200-056 | |
Vitamins | Sigma-Aldrich | M6895 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Mupid | MPDEXU-01 | |
CO2 Incubator | Thermo Scientific | Heracell 150i | |
Desktop Centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
Electroporator | Harvard Apparatus | ECM 830 | |
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) | UVP | UVGL-58 | |
Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 368826 | |
Thermocycler | Life Technologies (Applied Biosystems) | GeneAmp PCR System 9700 | |
Vortexer | Scientific Industries | G-560 | |
Water Bath | Jeio Tech | WB-10E |