In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.
The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.
Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.
제브라 피쉬는 신경 근육 질환 2,29의 연구를위한 강력한 도구로 부상하고있다. 현재까지, 제브라 피쉬 시스템은 새로운 근육 질환을 일으키는 돌연변이를 확인 16,17,30 신규 pathomechanisms 18을 해명하고, 잠재적으로 새로운 치료약 (12, 24)를 식별하는 데 사용되어왔다. 이러한 집단적인 노력은 인간의 신경 근육 질환을 모델링 할 수있는 제브라 피쉬의 유틸리티를 설립했다. 그러나, 제브라 피쉬와 포유 동물 모델로 만든 진보에도 불구하고, 신경 근육 조건의 넓은 스펙트럼 내에서 환자에 대한 제한적인 치료 옵션이 있습니다. 따라서, 수요는 파괴적인 질병이 그룹에 대한 치료 개발을 위해 존재한다. 치료법이 요구 평행하면 새로운 동물 모델 및 추정 치료 전략을 검증하는 실험 진행 혁신뿐만 아니라 엄격한 분석을위한 대응이 필요하다.
EBD 분석은 일반적으로 마우스 모델에서 사용연구 조직과 뇌, 심장에서 세포 손상 및 골격 근육 27,31. 특히, EBD 근육 세포막 불안정성의 정도를 표시하고 8 손상 근이영양증 다양한 아형의 마우스 모델에서 광범위하게 사용된다. 근육 세포막 손상을 드러내는 EBD의 사용은 인간의 질병 상태 (9) 동물 모델의 유사성을 확립지지 파라미터이다. 마우스에 EBD의 힘은 개발 및 신경 근육 질환의 제브라 피쉬 모델에 EBD를 적용, 우리 자신을 포함한 여러 실험실을 주도하고있다. EBD 인해 분석의 적용으로,이 기술은 활발 인간 질병 상태에 11,15,22,24,32 제브라 피쉬 모델을 확증하기 위해 구현되고있다. 손상된 근육 막과 유충은 근육 섬유 내의 EBD 흡수하기 때문에 적색 형광을해야합니다. 개별 근섬유 내의 섬유 간 공간에 형광 관찰 아니지만 역시 t의 기저막로부터 분리 섬유의 정보 일 수있다유용한 진단 세부 사항을 제공하는 멤브레인 손상의 그는 부재. EBD 분석은 동물 모델 검증을 넘어 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 우리의 실험실에서 노력은 최근 EBD 분석은 잠재적으로 새로운 치료 약물 (24)의 유효성을 검사에 도움이되도록 증명하고있다. 잠재적 인 치료 치료를 감소 시키거나 관련 치료 활동 (8)을 의미 할 수 있습니다 신경 근육 질환 모델에 EBD 흡수를 폐지 여부 확인. 이러한 유형의 분석 치료제 메커니즘 (들)을 설정하는 데 도움 EBD 및 분석 애플리케이션을 확대 할 수있다.
많은 기술과 마찬가지로, EBD 분석은 실험 설계 및 연습 동안 관찰 할 몇 가지주의 사항을 가지고있다. 예를 들어, 나이 인해 조직의 비후에 CCV를 식별하기 어려울 수있다. 또한, 실험 횟수를 줄이고 다수의 유충 수험 할 필요성을 증가 전과 심낭 주입 중에 제조에서 유충을 손상하기 쉽다.손상된 근육 EBD을 차지할 수 게다가, 처리 및 사출 동안 유충 짓을 물리적 손상은 오탐 (false positive)이 발생할 수 있습니다. 이러한 장애들을 극복하기 위해, 우리는 사출 전에 후속 분석 직후 성공적인 염료 주입과 유충 쉽고 신뢰할 수 있도록 식별이 비디오 문서 공동 사출 전략을 설명 하였다. 전에 근육 섬유로의 흡수로 혈관에 EBD의 확인을 허용하여 성공적으로 주입을위한 공동 분사 제어 FITC-덱스 트란. EBD 형광은 근육 섬유에서 수집되지 않을 경우 몇 시간 후 애벌레 매우 확산되면서 특히 유용 할 수있다; 이와 같이, 탐지하기 어려울 수있다. 또한, CCV 누락 및 노른자 또는 신체 공동으로 EBD를 주입하면, 배양 한 후, 손상된 근육 섬유에 의해 흡수의 감소 가능성과 아직 배아를 제어 할 유사한 확산 붉은 형광이 발생할 수 있습니다. 종합적으로,이 동굴ATS는 EBD 주입이 일관되고 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 인내와 연습이 필요 좋습니다.
모든에서는 제브라 애벌레 EBD 분석을 수행 실용적이고 간단한 방법을 설명한다. 지금까지 모델 시스템으로서 지브라 피쉬의 사용은 특히 인간의 질환 모델로서, 급속하게 확장되고있다. 이 확장은 제브라 피쉬 시스템의 현재 장점을 개선 실험 기술의 지속적인 개발 및 수정에 부분적으로 기인한다. EBD 주입 기술은 검증 및 제브라 피쉬 근육 질환 모델 연구를위한 연구자의 무기에 추가하고 강력한 도구를 제공합니다. 이 기술의 지속적인 구현 및 수정은 새로운 치료 전략뿐만 아니라 질병을 일으키는 메커니즘을 밝히기 도울 수있는 잠재력을 가지고있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 자신의 기술 지원을 트렌트 워 감사하고 싶습니다. 우리는 또한 아픈 아이들이 프로젝트에 대한 자신의 관대 한 자금에 대한 치료 선천성 근육 영양 장애 (CMD)의 병원에서 소아과를 인정합니다.
Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |