رصد الباطنة شبكية الكالسيوم باستخدام<em> Gaussia</em> luciferase المراسل SERCaMP
Summary
Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.
Abstract
الشبكة الإندوبلازمية (ER) يحتوي على أعلى مستوى الكالسيوم داخل الخلايا، مع تركيز حوالي 5000 أضعاف أكبر من مستويات هيولية. رقابة مشددة على ER الكالسيوم هي ضرورة حتمية للطي البروتين، وتعديل والاتجار. الاضطرابات إلى ER الكالسيوم يمكن أن يؤدي إلى تنشيط الاستجابة البروتين المطوية، وآلية الاستجابة للضغط النفسي ER ثلاثة الشق، وتسهم في التسبب في مجموعة متنوعة من الأمراض. القدرة على رصد التغيرات ER الكالسيوم أثناء ظهور المرض وتطور مهم من حيث المبدأ، ولكن التحدي في الممارسة العملية. وقد وفرت الوسائل المتاحة حاليا لرصد ER الكالسيوم، مثل الأصباغ والبروتينات الفلورية التي تعتمد على الكالسيوم ونظرة ثاقبة ديناميات ER الكالسيوم في الخلايا، ولكن هذه الأدوات ليست مناسبة تماما للدراسات في الجسم الحي. وقد أظهرت مختبرنا أن التعديل إلى محطة-كربوكسي من Gaussia luciferase المراسل يمنح إفراز مراسل استجابة لاستنزاف الكالسيوم ER. ووصف الطرق لاستخدام luciferase المراسل مقرها، ER يفرز البروتين مراقبة الكالسيوم (SERCaMP) لفي التجارب المختبرية وتطبيقات المجراة في هذه الوثيقة. هذا الفيديو يسلط الضوء على حقن الكبد، والتلاعب الدوائية للGLuc-SERCaMP، جمع الدم والتجهيز، والمعلمات فحص لرصد الطولي للER الكالسيوم.
Introduction
الشبكة الإندوبلازمية (ER) وظائف في العديد من القدرات الخلوية بما في ذلك لطي البروتين، وإفراز البروتين، والدهون التوازن، وداخل الخلايا مما يشير إلى 1. المركزية إلى وظيفة ER الطبيعية والحفاظ على تركيزات الكالسيوم اللمعية في ~ 5000 مرات تلك التي وجدت في السيتوبلازم 2-4. وينظم هذه العملية كثيفة الاستهلاك للطاقة من قبل أتباز ساركو / الشبكة الإندوبلازمية الكالسيوم (SERCA)، وهو المضخة التي تتحرك أيونات الكالسيوم في ER. وتوسطت هروب رأس المال من الكالسيوم من ER في المقام الأول من قبل ryanodine (RYR) وثلاثي اينوزيتول (IP3R) مستقبلات. لأن العديد من العمليات ER تعتمد على الكالسيوم، وتعطيل مخزن يمكن أن تؤدي إلى الإجهاد ER وموت الخلايا في نهاية المطاف.
ER وقد لوحظ التقلبات الكالسيوم في الأمراض بما في ذلك القلب والسكري ومرض الزهايمر، وباركنسون 5. ونظرا لطبيعة التدريجي لهذه الأمراض، فقد كان تحدي لتحديد السبب والنتيجة إعادةlationship بين المرضية والتغييرات في مخزن ER الكالسيوم. وقد سمحت لعدد من التقنيات لتحقيق تقدم كبير في فهمنا للديناميات ER الكالسيوم، بما في ذلك الأصباغ ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs). الأصباغ الكالسيوم تقارب منخفضة، مما يزيد في مضان عندما يتجهون الى كا 2+، يمكن تحميلها في الخلايا لفحص مقصورات التحت خلوية مع تركيزات عالية من الكالسيوم (6). GECIs، مثل D1ER والماسك تسمح لرصد تقلبات الكالسيوم مع مراقبة أكثر دقة لتوطين التحت خلوية 7-9. وقد وصفت مؤخرا، فئة أخرى من GECIs تسمى مؤشرات البروتين شرك عضية قياس الكالسيوم (CEPIA) 10. وثمة نهج ثالث يجمع بين علم الوراثة والكيمياء جزيء صغير هو استهداف استريز صبغ تحميل (TED)، الذي يستخدم إستيراز الكربوكسيل المشفرة وراثيا (تستهدف ER) مع الصبغة الكالسيوم القائم على استر 11.
في حين أن aforالنهج ementioned لها نقاط القوة ونقاط الضعف الكامنة، فإنها يمكن أن توفر معلومات قيمة حول ديناميات الكالسيوم ER من خلال القياسات الحادة من مضان. فهي، مع ذلك، ليس الأمثل للدراسات طولية غالبا المطلوبة لتحقيق تطور المرض. بهدف ابتكار طريقة لرصد ديناميات الكالسيوم على مدى فترات طويلة من الوقت، حددنا وضعت تعديل البروتين لخلق البروتينات مراقبة يفرز الكالسيوم ER (SERCaMPs) 12.
SERCaMP تلتف العديد من القيود المرتبطة منهجيات أخرى، من خلال توفير نهج مينيملي لاستجواب مرارا وتكرارا على مخزن ER الكالسيوم. لقد أثبتنا سابقا أن الببتيد ASARTDL-كربوكسي محطة (ألانين-سيرين-ألانين، أرجينين، ثريونين-الأسبارتيك حمض ليسين) كافية لتعزيز الاحتفاظ ER؛ ومع ذلك، في ظل الظروف التي تسبب انخفاض في ER الكالسيوم، وتسلسل الببتيد لم يعد قادرا على الاحتفاظ ER localizatioن ويفرز البروتين 13. على أساس من التكنولوجيا SERCaMP هو أطرافهم من ASARTDL إلى كربوكسي-محطة للبروتين يفرز (على سبيل المثال Gaussia luciferase المراسل، أو GLuc) بحيث إفراز يتم تشغيلها بواسطة نضوب ER الكالسيوم، وبالتالي خلق مراسل قوية من ER التقلبات الكالسيوم 12. التعبير عن GLuc-SERCaMP عبر وسائل المعدلة وراثيا يمكن السوائل البيولوجية بما في ذلك زراعة الخلايا المتوسطة والبلازما ليتم تحليلها لإجراء تغييرات في النشاط GLuc كمؤشر على التوازن ER الكالسيوم. طريقة تطبيقات لدراسة طولية من التعديلات التقدمية في مخزن الكالسيوم ER سواء في التجارب المختبرية والحية. يتم كتابة بروتوكول التالية باعتباره المخطط العام لاستخدام SERCaMP استنادا GLuc لدراسة ER الكالسيوم، ولكن البروتوكول يمكن أن تكون بمثابة دليل للSERCaMPs مراسل بديل.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يبرز في المختبر والمرافق الحيوية لGLuc-SERCaMP لمراقبة استنزاف ER الكالسيوم. على الرغم من أن التعديل البروتين لتوليد SERCaMP يبدو أن التعميم على البروتينات مراسل الأخرى 12، اخترنا Gaussia luciferase المراسل لمن القوي (200-1،000 أكبر أضعاف) تلألؤ بيولوجي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program at the National Institute on Drug Abuse. We thank Doug Howard, Chris Richie, Lowella Fortuno, and Josh Hinkle for their contributions to developing this method.
Materials
| 1.5mL tubes | Fisher | 02-682-550 | |
| 10% NP-40 solution | Pierce | 28324 | for intracellular GLuc assays |
| 1mL luer-lok syringes | Fisher | 14-823-30 | |
| 200uL filter tips | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 surgical sutures | Fisher | NC9598192 | |
| 30g needles | Fisher Scientific | 14-821-13A | |
| Adhesive microplate sealing sheets | Thermo | AB-0558 | |
| Alcohol prep pads | Fisher | 22-246-073 | |
| Anesthesia Auto Flow System | E-Z Anesthesia | EZ-AF9000 | |
| Animal recovery chamber | Lyon Vet | ICU-912-004 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
| Betadine solution | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Bovine growth serum | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| Cotton tipped applicators | Puritan | 806-WC | |
| Cutting needles 3/8 circle sutures | WPI | 501803 | |
| Digital ultrasconic cleaner | Fisher Scientific | FS60D | |
| DMEM high glucose, GlutaMAX, pyruvate | Life Technologies | 10569-010 | |
| DNA mass ladder | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (recombinant protein) | Nanolight | 321-100 | |
| Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC) | New England Biolabs | E8023S | 1:2000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| Gluc assay plates (96 well, opaque) | Fisher | 07-200-589 | |
| Hank's balanced salt solution | Life Technologies | 14175-095 | |
| Heparin | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| Isoflurane | Butler Schein | 29404 | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Kwik Stop Styptic powder | Butler Schein | 5867 | |
| L-glutamine | Sigma | G8540 | |
| Methanol | Fisher | a452-4 | |
| Microfuge 22R Centrifuge | Bekman Colter | 368831 | |
| Neosporin | Fisher | 19-898-143 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nikon Stereoscope | Nikon | SMZ745T | |
| Nucleospin Gel and PCR Cleanup | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 pipet | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 Lenti-X rapid titer kit | Clontech | 632200 | |
| PCR film seal | Fisher | AB0558 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| ReFresh Charcoal Filter canister | E-Z Anesthesia | EZ-258 | |
| Scalpel blades, #10 | Fine Science tools Inc | 10010-00 | |
| SD rats 150-200g | Charles River | Rats | rats ordered at 150-200g. Surgery 5 days after arrival |
| Small animal ear tags | National Band and Tag co | 1005-1 | |
| Sterile surgical drapes | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 plate reader | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | harmful to human health |
| Virapower lentiviral packaging mix | Life Technologies | K4975-00 | |
| Xfect Transfection reagent | Clontech | 631318 | |
| Xylazine | Valley Vet | 468RX |
Riferimenti
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38 (3-4), 303-310 (2005).
- Fu, S., et al. Aberrant lipid metabolism disrupts calcium homeostasis causing liver endoplasmic reticulum stress in obesity. Nature. 473 (7348), 528-531 (2011).
- Micaroni, M. The role of calcium in intracellular trafficking. Curr Mol Med. 10 (8), 763-773 (2010).
- Mekahli, D., Bultynck, G., Parys, J. B., De Smedt, H., Missiaen, L. Endoplasmic-reticulum calcium depletion and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (6), (2011).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Whitaker, M. Genetically encoded probes for measurement of intracellular calcium. Methods Cell Biol. 99, 153-182 (2010).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nat Commun. 5, 4153 (2014).
- Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44 (4), 386-399 (2008).
- Henderson, M. J., Wires, E. S., Trychta, K. A., Richie, C. T., Harvey, B. K. SERCaMP: a carboxy-terminal protein modification that enables monitoring of ER calcium homeostasis. Mol Biol Cell. 25 (18), 2828-2839 (2014).
- Henderson, M. J., Richie, C. T., Airavaara, M., Wang, Y., Harvey, B. K. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) secretion and cell surface binding are modulated by KDEL receptors. J Biol Chem. 288 (6), 4209-4225 (2013).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proc Soc Exp Biol Med. 130 (1), 305-310 (1969).
- Zigler, J. S., Lepe-Zuniga, J. L., Vistica, B., Gery, I. Analysis of the cytotoxic effects of light-exposed HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 21 (5), 282-287 (1985).
- Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
- Smeets, E. F., Heemskerk, J. W., Comfurius, P., Bevers, E. M., Zwaal, R. F. Thapsigargin amplifies the platelet procoagulant response caused by thrombin. Thromb Haemost. 70 (6), 1024-1029 (1993).
- Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (4), 582-591 (2009).
- Sobrevals, L., et al. AAV vectors transduce hepatocytes in vivo as efficiently in cirrhotic as in healthy rat livers. Gene Ther. 19 (4), 411-417 (2012).
- Wang, Z., et al. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (26), 2105-2111 (2003).
- Seppen, J., et al. Adeno-associated virus vector serotypes mediate sustained correction of bilirubin UDP glucuronosyltransferase deficiency in rats. Mol Ther. 13 (6), 1085-1092 (2006).
- Hareendran, S., et al. Adeno-associated virus (AAV) vectors in gene therapy: immune challenges and strategies to circumvent them. Rev Med Virol. 23 (6), 399-413 (2013).
