Methoden om de regulerende rol van kleine RNA's en Ribosomaal bezetting van Onderzoek<em> Plasmodium falciparum</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

De genetische variatie die verantwoordelijk is voor het sikkelcel allel (GB) stelt erytrocyten om infectie te weerstaan ​​door de malariaparasiet, P. falciparum. De moleculaire basis van deze weerstand, waarvan bekend is multifactorieel, blijft onvolledig begrepen. Recente studies gevonden dat de differentiële expressie van erytrocyten microRNAs, zodra translocatie in malariaparasieten, invloed hebben op zowel genregulatie en de parasiet groei. Deze miRNAs werden later aangetoond dat mRNA translatie te remmen door de vorming van een chimeer RNA-transcript via 5 'RNA fusie met discrete subsets van parasiet mRNA. Hier zijn de technieken die werden gebruikt om de functionele rol en vermeende onderliggende mechanisme erytrocyt microRNA op genregulatie en translationele potentieel van P. bestuderen falciparum, waaronder transfectie van gemodificeerde synthetische microRNA in gastheercellen erytrocyten, zal worden gedetailleerd. Ten slotte wordt een polysoom gradiënt methode die wordt gebruikt om te bepalen van de omvang van translation van deze transcripten. Samen vormen deze technieken konden we aantonen dat het ontregelde niveaus van erytrocyten microRNA's bijdragen aan de cel-intrinsieke malaria weerstand van sikkel erytrocyten.

Introduction

Malaria wordt veroorzaakt door apicomplexa parasieten van het geslacht Plasmodium, is de meest voorkomende menselijke parasitaire ziekte, wereldwijd infecteren ongeveer 200 miljoen mensen per jaar en het veroorzaken van zo'n 600.000 doden ^1. Van de vijf Plasmodium soorten die de mens infecteren, het meest relevant zijn voor de menselijke ziekte P. falciparum en P. vivax, vanwege hun brede verdelingen en wat ernstige malaria complicaties. De levenscyclus van de malariaparasiet vereist infectie van zowel muggen en mens. Wanneer een geïnfecteerde mug bijt een mens, de parasieten reizen via de bloedbaan naar de lever, waarbij een eerste ronde van de replicatie plaatsvindt. Na merozoites breuk van de gastheer hepatocyten, die ze infecteren nabijgelegen rode bloedcellen, het initiëren of aseksuele en seksuele replicatie. De aseksuele fase van replicatie, die 48 uur duurt di P. falciparum, is de focus van dit onderzoek, aangezien het zowel de bron van de meeste malaria symptomen en gemakkelijk gerecapituleerd in vitro.

Terwijl een aantal initiatieven voor de volksgezondheid, waaronder verbeterde anti-malaria therapieën, enigszins verminderde de last van malaria wereldwijd, de voortdurende opkomst van resistente parasieten vormt een probleem voor malaria controle-inspanningen. Een gebied waarop nieuwe therapeutische benaderingen kunnen voorstellen is de studie over hoe de verschillende genetische varianten resistentie tegen malaria. In malaria-endemische gebieden, een verscheidenheid aan erythrocytische polymorfismen zijn vrij algemeen ^2,3. Deze mutaties, met sikkelcelziekte zijn misschien de meest prominente, vaak geassocieerd met aanzienlijke weerstand tegen het ontstaan ​​van symptomatische malaria ^4. De onderliggende mechanismen die ze veroorzaken erytrocyten aan malaria-infectie te weerstaan ​​zijn onvolledig begrepen. Geparasiteerde erytrocyten met hemoglobine mutaties zijn onderhevig aan verbeterde fagocytose door een betere cellulaire stijfheid en uitdroging, dieis geassocieerd met verminderde invasie van P. Falciparum ^5. De HbC allel ook invloed op eiwitexpressie in de erytrocyten oppervlak en de hermodellering van het cytoskelet, verdere ontwikkeling remmen parasiet ^6,7. Tenslotte P. falciparum groeit slecht binnen homozygote sikkel (HbSS) erytrocyten ^8,9 in vitro, wat suggereert intrinsieke erythrocytaire factoren van malaria weerstand. Hoewel al deze mechanismen blijken een rol te spelen, zij niet volledig de mechanismen achter sikkelcel resistentie tegen malaria leggen.

Een mogelijke set erythrocytische factoren die slecht blijven begrepen is het grote zwembad van miRNA aanwezig is in rijpe erytrocyten. MicroRNAs zijn kleine niet-coderende RNA's 19-25 nt in grootte, die translatie en / of stabiliteit van target mRNAs bemiddelen door basenparing binnen de 3 'UTR. Ze zijn betrokken bij de controle van zoogdier immuunresponsen, zoals de onderdrukking of virusreplicatie ^10, en werden naar resistentie tegen virussen in planten Zij hebben ook aangetoond dat verschillende erythrocytische processen, waaronder erytropoëse ^11,12 en ijzerstofwisseling ¹³ reguleren. Eerdere studies die een rijke en gevarieerde bevolking van erythrocytische miRNAs, waarvan de expressie is dramatisch veranderd in HBSS erytrocyten ^14,15. Sinds rijpe erytrocyten gebrek actieve transcriptie en translatie, de functionele rol van deze erytrocyten miRNAs blijft onduidelijk. Zo belangrijk materiaal uitwisseling plaatsvindt tussen de gastheercel en P. falciparum tijdens de intraerythrocytic ontwikkelings cyclus (IDC) ^16, werd gespeculeerd dat de veranderde miRNA profiel binnen HbS erytrocyten direct kunnen bijdragen aan de cel-intrinsieke malaria weerstand.

Deze studies leidde uiteindelijk tot de ontwikkeling van een pijpleiding voor het isoleren, identificeren en functioneel bestuderen van de rol van menselijke miRNA in de malaria parasiet, P. falciparum, die aangaf dat de gastheer / menselijke miRNAs uiteindelijk covalent zekering en vervolgens translationeel onderdrukken parasiet mRNA-transcripten ^17. Dit verschaft een voorbeeld van het eerste cross-species chimere transcripten gevormd door trans-splicing en impliceert dat miRNA-mRNA-fusie kan optreden in andere soorten, waaronder andere parasieten. Alle trypanosoom mRNA trans-splicing met een splice-leader (SL) de scheiding van polycistronische ¹⁸ transcripten reguleren. Aangezien P. falciparum ontbreekt orthologen voor Dicer / Ago ^19,20, is het mogelijk dat erytrocyten miRNAs kapen vergelijkbare SL machines di P. falciparum te integreren in target genen. Recente studies di P. falciparum in feite gaf de aanwezigheid van 5 'splice leadersequenties ^21. Deze studie beschrijft de methodes die tot de ontdekking van humane parasieten miRNA-mRNA fusietranscripten, zowel transcriptoom en translanale regelgeving technieken. De algemene doelstelling van deze methoden om de effecten van kleine RNAs in genregulatie, fenotypen en vertaling potentieel van P. onderzoeken falciparum transcripties.

De initiële identificatie van humane parasieten chimere transcripten aangevoerd gebruik van RNA analysetechnieken, zoals real-time PCR, sequencing en transcriptoom EST bibliotheek vangen, die zowel totaal en kleine RNAs, in plaats van technieken die op geïsoleerde kleine RNA inbegrepen. Isoleren alle RNA samen in een grote pool, in plaats van afzonderlijk het mogelijk gemaakt zowel translocatie menselijke kleine RNA in de parasiet en de aanwezigheid van deze kleine RNA-sequenties als deel van een grotere sequentie. Dit vereist dan een analyse van de translatietoestand van deze fusie-mRNA's om de functionele consequenties van deze fusies bepalen.

Terwijl de uitgebreide inspanningen op het karakteriseren van de parasiet genoom eend transcriptome hebben toegevoegd aan het begrip van de parasiet biologie ^22-25, veel minder bekend over de translationele regulering van het mRNA transcriptoom over de levenscyclus van P. ²⁶ falciparum. Deze beperkte begrip van proteoom de parasiet heeft zowel begrip van de biologie van de parasiet en de mogelijkheid om nieuwe targets te identificeren voor de volgende generatie van anti-malaria therapeutische gehinderd. Deze kloof in het begrijpen van cellulaire biologie van de parasiet is grotendeels te wijten aan het gebrek aan passende technieken bleef translationeel regelgeving P. onderzoeken falciparum. Een recent artikel beschreef het gebruik van ribosomale footprinting van P. falciparum de wereldwijde vertaalstatus ²¹ te bepalen. Een gevestigde meting van translatie van transcripten mogelijk is het aantal geassocieerde ribosomen bepaald polysoomdisplays profilering. Echter, wanneer deze techniek wordt toegepast voor P. falciparum </ em>, het is niet in staat om de meeste polysomen herstellen en vangt overwegend monosomes. Onlangs hebben diverse groepen ^27,28 P. geoptimaliseerd falciparum polysoom technieken door lyseren van de erytrocyten en parasiet gelijktijdig aan de polysomen behouden en te karakteriseren de ribosomale bezetting en translationele potentieel van deze malariaparasieten tijdens hun ongeslachtelijke ontwikkeling in gastheer rode bloedcellen ^28.

Tezamen zijn deze werkwijzen tonen dat de waargenomen fusie van menselijke miRNA parasitaire mRNAs moduleert parasiet eiwittranslatie van die fusie-mRNA, waarbij werd aangetoond met eerder beschreven werkwijzen ²⁷ en is een belangrijke determinant van malaria resistentie in HbAS en HbSS erytrocyten ^17. Deze methoden zou nuttig zijn in elk systeem op zoek naar RNA splicing gebeurtenissen identificeren en functioneel te verkennen, of die fusie RNA's zijn binnen P. falciparum of andere eukaryotische systemen.

Protocol

1: Isolatie van Kleine en middelgrote RNA's van P. falciparum Tijdens de IDC Verkrijgen malariaparasieten in aseksuele cultuur 29. LET OP: De benodigde cultuur grootte zal variëren op basis van de gewenste toepassing; Maar een kweek 10 ml van 3-5% parasitemie en 5% hematocriet biedt voldoende RNA voor real-time PCR (RT-PCR). De techniek werd aanvankelijk geoptimaliseerd voor asynchrone kweken, maar wanneer specifieke tijdstippen gedurende de infectiecyclus gewenst, kan ring-par…

Representative Results

Wereldwijde profilering van menselijke microRNA in P. falciparum De hier gepresenteerde technieken werden gebruikt om microRNAs van parasieten extract in verschillende omstandigheden. Een ding om op te merken is dat RNA extracties voor niet-geïnfecteerde rode bloedcellen werden uitgevoerd zoals aangegeven in 32, die vaak diende als een referentiepunt voor de microRNA gegevens in zowel dit artikel en de oorspronkelijke studie 29. Die eerdere studies to…

Discussion

HbS is een van de meest voorkomende hemoglobinevarianten malaria endemische gebieden, vooral omdat het bescherming tegen ernstige malaria veroorzaakt door P. falciparum. De technieken die nodig zijn om de rol van menselijke microRNA karakteriseren in genregulatie P. falciparum zijn beschreven in dit manuscript. Door extractie van totaal RNA op zodanige wijze dat alle kleine RNA's omvatten, en door het uitvoeren van een relatief eenvoudige parasiet lysis procedure die fusie RNA's konden worden g…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)