طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال<em> المتصورة المنجلية</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

التباين الوراثي المسؤول عن أليل المنجلي (HBS) يمكن الكريات الحمراء أن تقاوم العدوى عن طريق طفيلي الملاريا، P. المنجلية. الأساس الجزيئي لهذه المقاومة، والذي يعرف لتكون سياقاتها، لا تزال غير مفهومة. وجدت الدراسات الحديثة أن التعبير التفاضلية من microRNAs كرات الدم الحمراء، translocated مرة واحدة في طفيليات الملاريا، تؤثر على كل من تنظيم الجينات والنمو الطفيلي. وقد أظهرت هذه miRNAs في وقت لاحق لمنع الترجمة مرنا من خلال تشكيل نسخة RNA خيالية عبر 5 "الانصهار RNA مع مجموعات فرعية سرية للمن mRNAs الطفيلي. هنا، والتقنيات التي استخدمت لدراسة دور وظيفي والمفترضة آلية microRNAs كرات الدم الحمراء الكامنة على تنظيم الجينات وإمكانات متعدية من P. المنجلية، بما في ذلك ترنسفكأيشن من microRNAs الاصطناعية تعديل في كريات الدم الحمراء المضيف، سيتم تفصيله. وأخيرا، يتم استخدام طريقة polysome التدرج لتحديد مدى هيئة تنظيم الاتصالاتnslation من هذه النصوص. معا، سمحت هذه التقنيات لنا لإثبات أن مستويات dysregulated من microRNAs كرات الدم الحمراء تساهم في مقاومة الملاريا خلايا كريات الدم الحمراء المنجلية الجوهرية.

Introduction

الملاريا، التي تسببها الطفيليات apicomplexan من جنس المتصورة، هو مرض طفيلي البشري الأكثر شيوعا، وتصيب عالميا ما يقرب من 200 مليون شخص كل عام، وتسبب حوالي 600،000 حالة وفاة ^1. من الأنواع المتصورة الخمسة التي تصيب البشر، والأكثر صلة الأمراض التي تصيب البشر هي P. المنجلية وP. النشيطة، ويرجع ذلك إلى توزيع واسعة النطاق واحتمال حصول مضاعفات حادة بالملاريا. دورة حياة طفيل الملاريا تتطلب إصابة كل من البعوض والبشر. عندما تلدغ بعوضة مصابة الإنسان، والطفيليات السفر عبر مجرى الدم إلى الكبد، حيث تحدث في الجولة الأولى من النسخ المتماثل. بعد merozoites تمزق من الكبدية المضيفة، فإنها تصيب خلايا الدم الحمراء القريبة، بدء النسخ المتماثل إما اللاجنسي والجنسي. المرحلة اجنسي النسخ المتماثل، الذي يستمر 48 ساعة في P. المنجلية، هو محور هذه الدراسة لأنه على حد سواء مصدر معظم المالأعراض الأغنية ولخص بسهولة في المختبر.

في حين أن عددا من المبادرات الصحية العامة، بما في ذلك تحسين العلاجات المضادة للملاريا، قد قللت إلى حد ما من عبء الملاريا على الصعيد العالمي، واستمرار ظهور الطفيليات المقاومة للأدوية يمثل مشكلة لجهود مكافحة الملاريا. منطقة واحدة والتي قد تشير إلى طرق علاجية جديدة هي دراسة عن كيفية مختلف المتغيرات الجينية تمنح المقاومة للملاريا. في المناطق التي تتوطن فيها الملاريا، ومجموعة متنوعة من الأشكال الكريات الحمراء شائعة جدا ^2،3. هذه الطفرات، مع خلية المنجل يجري لعل أبرز، غالبا ما ترتبط مع المقاومة كبيرة لظهور أعراض الإصابة بالملاريا ^4. وغير مفهومة الآليات الكامنة التي كانت تسبب الكريات الحمراء أن تقاوم الإصابة بالملاريا. الكريات الحمراء مطفول مع الطفرات الهيموجلوبين تخضع لتعزيز البلعمة من خلال تعزيز صلابة الخلوية والجفاف، والتيويرتبط مع غزو بنسبة P. المتصورات المنجلية ^5. يؤثر على أليل HBC أيضا تعبير البروتين على سطح كرات الدم الحمراء ومع إعادة تشكيل الهيكل الخلوي، مما يزيد من إعاقة التنمية الطفيلي ^6،7. وأخيرا، P. المنجلية ينمو بشكل سيئ داخل المنجل متماثل (HBSS) الكريات الحمراء ^8،9 في المختبر، مما يشير إلى العوامل الكريات الحمراء الجوهرية للمقاومة الملاريا. ومع ذلك، في حين أن جميع هذه الآليات يبدو أن تلعب دورا، لكنها لا تفسر تماما الآليات وراء مقاومة الخلايا المنجلية للملاريا.

مجموعة واحدة محتمل من العوامل الكريات الحمراء التي لا تزال غير مفهومة هو مجموعة كبيرة من ميرنا موجودة في كرات الدم الحمراء الناضجة. MicroRNAs هي الرنا غير المكودة صغيرة، 19-25 الإقليم الشمالي في الحجم، الذي توسط الترجمة و / أو استقرار من mRNAs الهدف عن طريق الاقتران قاعدة داخل 'UTR 3. قد تورطت أنهم في السيطرة على الاستجابات المناعية الثدييات، بما في ذلك قمع سو تكاثر الفيروس ^10، وعرضت للتشاور المقاومة للفيروسات في النباتات كما تم أظهروا لتنظيم العديد من العمليات الكريات الحمراء، بما في ذلك الكريات الحمر ^11،12 واستقلاب الحديد ^13. حددت دراسات سابقة السكان وفيرة ومتنوعة من miRNAs الكريات الحمراء، الذي التعبير تم تغيير بشكل كبير في HBSS الكريات الحمراء ^14،15. منذ كريات الدم الحمراء الناضجة تفتقر النسخ النشط والترجمة، ودور وظيفي من هذه miRNAs كرات الدم الحمراء لا يزال غير واضح. كما يحدث تبادل مادي كبير بين الخلية المضيفة وP. المنجلية خلال دورة التنموية داخل الكريات الحمر (IDC) ^16، وكانت هناك تكهنات بأن الملف الشخصي ميرنا غيرت داخل كريات الدم الحمراء HBS قد تسهم بشكل مباشر في مقاومة الملاريا الخلايا الذاتية.

هذه الدراسات أدى في النهاية إلى تطوير خط أنابيب لعزل وتحديد وظيفيا دراسة دور ميرنا البشري داخل مالجناحية الطفيلي، P. المنجلية، التي أشارت إلى أن تلك المضيف / miRNAs الإنسان في نهاية المطاف تساهميا فتيل ثم تقمع translationally النصوص الطفيلي مرنا ^17. قدمت هذا مثال من أول عبر أنواع النصوص خيالية شكلتها العابر للالربط وتورط أن هذا الانصهار ميرنا-مرنا يمكن أن تحدث في الأنواع الأخرى، بما في ذلك الطفيليات الأخرى. كل من mRNAs المثقبيات هي العابرة تقسم مع لصق زعيم (SL) لتنظيم الفصل بين النصوص متعدد المقارين ^18. منذ P. المنجلية يفتقر orthologs لالمقامر / منذ ^19،20، فمن الممكن أن miRNAs كرات الدم الحمراء يخطفون الآلات SL مماثلة في P. المنجلية للاندماج الجينات المستهدفة. الدراسات التي أجريت مؤخرا في P. المنجلية يكون في الواقع أشارت إلى وجود 5 'تسلسل زعيم لصق ^21. تفاصيل هذه الدراسة الأساليب التي أدت إلى اكتشاف للطفيليات الإنسان ميرنا-مرنا النصوص الانصهار، بما في ذلك transcriptomic وtranslaتقنيات تنظيم tional. الأهداف العامة لهذه الأساليب هي للتحقيق في آثار الرنا صغيرة في تنظيم الجينات، الظواهر والترجمة إمكانات P. النصوص المنجلية.

تحديد الأولي من النصوص خيالية-الطفيليات البشرية الاعتماد على استخدام تقنيات تحليل الحمض النووي الريبي، مثل الوقت الحقيقي PCR، والتسلسل Transcriptome على وEST القبض على المكتبة، والتي شملت كل من إجمالي والصغيرة الرنا، بدلا من استخدام التقنيات التي معزولة فقط الرنا الصغيرة. عزل جميع RNA معا في تجمع واحد كبير، وليس بشكل منفصل، يسمح بتحديد كل من الرنا صغيرة الإنسان translocated في الطفيليات وكذلك وجود هذه تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة كجزء من سلسلة أكبر. هذا ثم يطلب تحليلا للدولة ترجمة هذه من mRNAs الانصهار لتحديد العواقب الوظيفية لهذه اندماج.

في حين جهود واسعة النطاق على توصيف الجينوم والطفيليوأضافت د Transcriptome على لفهم البيولوجيا الطفيلي ^22-25، كما هو معروف أقل بكثير عن تنظيم متعدية من Transcriptome على مرنا عبر دورة حياة P. المنجلية ^26. هذا الفهم المحدود للبروتيوم الطفيلي أعاق على حد سواء فهم البيولوجيا الطفيلي والقدرة على تحديد أهداف جديدة للجيل القادم من العلاجات المضادة للملاريا. وقد استمرت هذه الفجوة في فهم بيولوجيا الخلية الطفيلي يرجع إلى حد كبير إلى عدم وجود تقنيات كافية للتحقيق في تنظيم متعدية في P. المنجلية. ووصفت ورقة واحدة الأخيرة استخدام البصمة الريباسي من P. المنجلية لتحديد حالة الترجمة العالمي ^21. واحدة قياس راسخة من إمكانات متعدية من النصوص هو عدد ريبوسوم المرتبطة يحددها polysome التنميط. ومع ذلك، عندما يتم تطبيق هذه التقنية لP. المنجلية </ م>، فإنه غير قادر على استعادة معظم polysomes ويلتقط الغالب monosomes. في الآونة الأخيرة، عدة مجموعات ^27،28 وقد الأمثل P. تقنيات polysome المنجلية من قبل الناشر لكرات الدم الحمراء والطفيليات في وقت واحد للحفاظ على polysomes وتميز الإشغال الريباسي وإمكانات متعدية هذه طفيليات الملاريا خلال تطوير اللاجنسي في المضيف خلايا الدم الحمراء ^(28).

بشكل جماعي، وهذه الأساليب تدل على أن الانصهار الملحوظ من الإنسان ميرنا والطفيليات من mRNAs ينظم ترجمة البروتين الطفيلي تلك من mRNAs الانصهار، والذي تجلى باستخدام أساليب ذكرت سابقا ^27، و هي المحدد الرئيسي لمقاومة الملاريا في مهايئات الناقل المضيف وHBSS الكريات الحمراء ^(17). أن هذه الأساليب تكون مفيدة في أي نظام تتطلع لتحديد وظيفيا استكشاف الأحداث RNA الربط، سواء كانت تلك الرنا الانصهار ضمن P. المنجلية أو أنظمة حقيقيات النوى الأخرى.

Protocol

1: عزل الرنا صغيرة الحجم من P. المنجلية خلال IDC الحصول على طفيليات الملاريا في الثقافة اللاجنسي 29. ملاحظة: تختلف حجم الثقافة المطلوبة استنادا إلى التطبيق المطلوب. ومع ذلك، ثقافة 10 مل في 3-5٪ الطفيل و 5٪ الهيم…

Representative Results

التنميط العالمي من الرنا الميكروي البشري في P. المنجلية استخدمت التقنيات المعروضة هنا لاستخراج microRNAs من الطفيليات في مجموعة متنوعة من الظروف. شيء واحد هو أن نلاحظ أن أجريت عمليات الاستخراج RNA لكرات الدم الحمراء غير المصابة ك?…

Discussion

مسح ميزانية الأسرة هي واحدة من المتغيرات الهيموجلوبين الأكثر شيوعا في المناطق الموبوءة الملاريا، إلى حد كبير لأن ذلك يوفر الحماية ضد الملاريا الحادة التي تسببها P. المنجلية. التقنيات اللازمة لتوصيف دور الرنا الميكروي البشري في تنظيم الجينات من P. وترد تفاص?…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)