Méthodes pour étudier le rôle de réglementation de petits ARN ribosomal et l'occupation des<em> Plasmodium falciparum</em

Summary

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Abstract

La variation génétique responsable de l'allèle drépanocytaire (HbS) permet érythrocytes à résister à l'infection par le parasite du paludisme, P. falciparum. La base moléculaire de cette résistance, qui est connu pour être multifactorielle, reste mal compris. Des études récentes ont constaté que l'expression différentielle des microARN érythrocytaires, une fois transplantées dans des parasites du paludisme, affectent à la fois la régulation des gènes et de la croissance du parasite. Ces miARN ont ensuite été présentés pour inhiber la traduction de l'ARNm en formant une transcription de l'ARN chimérique via 5 «fusion d'ARN avec des sous-ensembles discrets d'ARNm de parasites. Ici, les techniques qui ont été utilisées pour étudier le rôle fonctionnel et mécanisme putatifs microARN érythrocytaires sous-jacentes sur la régulation des gènes et le potentiel de translation de P. falciparum, y compris la transfection de microARN synthétiques modifiés dans les érythrocytes d'accueil, seront détaillées. Enfin, une méthode de gradient de polysomes est utilisée pour déterminer l'étendue de translation de ces transcriptions. Ensemble, ces techniques nous ont permis de démontrer que les niveaux dérégulés de microARN érythrocytaires contribuent à la résistance du paludisme cellule-intrinsèque des érythrocytes falciformes.

Introduction

Le paludisme, causée par des parasites apicomplexes du genre Plasmodium, est la maladie parasitaire la plus fréquente humaine, infectant globalement environ 200 millions de personnes chaque année et provoque environ 600.000 décès ^1. Parmi les cinq espèces de Plasmodium qui infectent les humains, les plus pertinents à la maladie humaine sont P. falciparum et P. vivax, en raison de leurs distributions généralisées et le potentiel pour des complications graves de paludisme. Le cycle de vie du parasite de la malaria infection nécessite à la fois les moustiques et les humains. Quand un moustique infecté pique un humain, les parasites dans la circulation sanguine vers le foie, où une première série de réplication. Après mérozoïtes rupture de l'hépatocyte hôte, ils infectent les globules rouges à proximité, initier la réplication soit sexuée ou asexuée. Le stade asexué de réplication, qui dure 48 heures dans P. falciparum, est l'objet de cette étude, car il est à la fois la source de la plupart malsymptômes aria et est facilement récapitulées in vitro.

Bien qu'un certain nombre d'initiatives de santé publique, y compris l'amélioration des thérapies anti-paludiques, ont quelque peu réduit la charge du paludisme à l'échelle mondiale, l'émergence continue de parasites résistants aux médicaments pose un problème pour les efforts de lutte contre le paludisme. Un aspect qui pourrait suggérer de nouvelles approches thérapeutiques est l'étude sur la façon dont diverses variantes génétiques confèrent une résistance au paludisme. Dans les régions où le paludisme est endémique, une variété de polymorphismes érythrocytaires sont assez commun ^2,3. Ces mutations, avec la drépanocytose étant peut-être le plus important, sont souvent associées à une résistance substantielle à l'apparition de l'infection paludéenne ⁴ symptomatique. Les mécanismes sous-jacents qui causent érythrocytes ils à résister aux infections de paludisme sont encore mal compris. Hématies parasitées avec des mutations de l'hémoglobine sont soumis à la phagocytose renforcée par la rigidité cellulaire accrue et la déshydratation, quiest associé à une diminution de l'invasion par P. ⁵ falciparum. L'allèle HbC affecte également l'expression des protéines à la surface des érythrocytes et avec le remodelage du cytosquelette, l'inhibition de la poursuite du développement du parasite ^6,7. Enfin, P. falciparum pousse mal dans les falciformes homozygote (HbSS) ^8,9 érythrocytes in vitro, suggérant facteurs érythrocytaires intrinsèques de résistance du paludisme. Cependant, alors que l'ensemble de ces mécanismes semblent jouer un rôle, ils ne expliquent pas complètement les mécanismes derrière la résistance de la drépanocytose au paludisme.

Un ensemble potentiel des facteurs érythrocytaires qui restent mal compris est la grande piscine de miARN présents dans les érythrocytes matures. Les microARN sont de petits ARN non codants, 19-25 nt de taille, qui médient la traduction et / ou la stabilité des ARNm cibles par appariement de bases à l'intérieur de la 3 'UTR. Ils ont été impliqués dans la régulation de la réponse immunitaire des mammifères, y compris la suppression of ¹⁰ la replication du virus, et ont été montrés pour conférer une résistance aux virus dans des plantes Ils ont également été montré pour réguler plusieurs processus, y compris l'érythropoïèse érythrocytaires ^11,12 et ¹³ le métabolisme du fer. Des études précédentes ont identifié une population abondante et diversifiée des miARN érythrocytaires, dont l'expression a été considérablement modifié dans HbSS érythrocytes ^14,15. Depuis érythrocytes matures manquent transcription active et la traduction, le rôle fonctionnel de ces miARN érythrocytaires reste incertaine. En échange de matière important se produit entre la cellule hôte et P. falciparum au cours du cycle de développement intra-érythrocytaire (IDC) ^16, il a été spéculé que le profil miARN modifié au érythrocytes HbS peut contribuer directement à la résistance du paludisme cellule-intrinsèque.

Ces études ont finalement abouti à l'élaboration d'un pipeline pour isoler, identifier et fonctionnellement étudier le rôle des miARN humain dans le malaria parasite, P. falciparum, qui a indiqué que ces hôtes / miARN humains finalement covalente fusible puis réprimer translation parasite transcriptions d'ARNm ^17. Cela a fourni un exemple des premiers inter-espèces transcriptions chimériques formés par trans-épissage et implique que cette fusion miARN-ARNm pouvait se produire chez d'autres espèces, y compris d'autres parasites. Tous les ARNm trypanosomes sont trans-épissage avec une épissure leader (SL) pour réguler la séparation des transcriptions polycistroniques ^18. Depuis P. falciparum manque orthologues pour Dicer / Ago ^19,20, il est possible que miARN érythrocytaires détournent SL machines similaires dans P. falciparum à intégrer dans les gènes cibles. Des études récentes dans P. falciparum ont en effet indiqué la présence de 5 'des séquences de tête ²¹ d'épissage. Cette étude détaille les méthodes qui ont conduit à la découverte de l'homme-parasite miARN-ARNm transcrits de fusion, y compris à la fois transcriptomique et traductechniques de régulation supplémentaires. Les objectifs généraux de ces méthodes sont d'étudier les effets de petits ARN dans la régulation des gènes, les phénotypes et la traduction potentiel de P. transcriptions falciparum.

L'identification initiale des transcriptions chimères humains-parasite invoqué l'utilisation des techniques d'analyse d'ARN, comme PCR en temps réel, le séquençage du transcriptome et la bibliothèque capture HNE, qui comprenait à la fois totale et petits ARN, plutôt que d'utiliser des techniques qui ne isolés petits ARN. Isolement de l'ARN tous ensemble dans une grande piscine, plutôt que séparément, a permis l'identification de deux petits ARN humains translocation dans le parasite ainsi que la présence de ces petites séquences d'ARN en tant que partie d'une séquence plus grande. Ce alors requis une analyse de l'état de la traduction de ces ARNm de fusion afin de déterminer les conséquences fonctionnelles de ces fusions.

Bien que des efforts considérables sur la caractérisation du génome de l'un du parasited transcriptome ont ajouté à la compréhension de la biologie du parasite ^22-25, loin on connaît moins la régulation de la traduction de l'ARNm du transcriptome à travers le cycle de vie de P. ²⁶ falciparum. Cette compréhension limitée du protéome du parasite a entravé la fois la compréhension de la biologie du parasite et la capacité à identifier de nouvelles cibles pour la prochaine génération de thérapies anti-paludiques. Cet écart dans la compréhension de la biologie cellulaire du parasite a persisté principalement en raison de l'absence de techniques adéquates pour enquêter régulation de la traduction dans P. falciparum. Un récent document décrit l'utilisation de l'empreinte ribosomal de P. falciparum pour déterminer le statut de la traduction globale ^21. Une mesure de potentiel bien établie de translation de la transcription est le nombre de ribosomes associés déterminés par polysomes profilage. Cependant, lorsque cette technique est appliquée à P. falciparum </ em>, il est incapable de récupérer la plupart des polysomes et capte principalement monosomes. Récemment, plusieurs groupes ^27,28 ont optimisé P. techniques de polysome falciparum par lyse des érythrocytes et le parasite simultanément pour préserver les polysomes et de caractériser l'occupation ribosomique et le potentiel de translation de ces parasites du paludisme au cours de leur développement asexuée dans des cellules hôtes rouges ^28.

Collectivement, ces méthodes montrent que la fusion observée des ARNm miRNA et parasite humain module traduction de ces ARNm de fusion, qui a été démontré en utilisant des méthodes précédemment rapportés ²⁷ protéines du parasite, et est un déterminant majeur de la résistance du paludisme dans HbAS et HbSS érythrocytes ^17. Ces procédés seraient utiles dans n'importe quel système cherche à identifier et à explorer fonctionnellement événements d'épissage d'ARN, si ces ARN de fusion sont dans un rayon P. falciparum ou d'autres systèmes eucaryotes.

Protocol

1: Isolement des ARN de petite taille à partir de P. Au cours de l'IDC falciparum Obtenir parasites du paludisme dans la culture asexuée 29. NOTE: La taille de culture nécessaire varie en fonction de l'application désirée; Cependant, une culture de 10 ml à 5.3% et 5% de parasitémie hématocrite fournit suffisamment d'ARN pour PCR en temps réel (RT-PCR). La technique a été initialement optimisé pour les cultures asynchrones, mais quand des moments pré…

Representative Results

Profilage de microARN humaine globale dans P. falciparum Les techniques présentées ici ont été utilisés pour extraire les micro-ARN à partir de parasites dans une variété de conditions. Une chose à noter est que les extractions d'ARN pour les globules rouges non infectés ont été effectués comme indiqué dans le 32, qui a souvent servi de point pour les données de microARN présentés à la fois dans cet article et l'étude originale 29<…

Discussion

HbS est l'un des variants de l'hémoglobine les plus communs dans les zones d'endémie du paludisme, en grande partie parce qu'elle offre une protection contre le paludisme grave causée par P. falciparum. Les techniques nécessaires pour caractériser le rôle des microARN humaine dans la régulation des gènes de P. falciparum sont détaillées tout au long de ce manuscrit. En extrayant l'ARN total dans une manière à inclure tous les petits ARN, et en effectuant une pro…

Materials

REAGENTS-All reagents must be RNAse-free.

Diethyl pyrocarbonate (DEPC; Sigma, cat. no. D5758)

DEPC-treated water (see REAGENT SETUP)

Yoyo-1 DNA fluorescent dye (Thermo Fisher)

Gene Pulser II (or comparible) electroporator (Bio-Rad)

0.2 cm Electroporation cuvettes

4 M potassium acetate (Mallinckrodt, cat. no. 6700)

2 M potassium HEPES (pH 7.2; Sigma, cat. no. H0527)

1 M magnesium acetate (Sigma, cat. no. M-2545)

1 M dithiothreitol (DTT; Research Products International, cat. no. D11000)

100 mM phenylmethylsulfonate fluoride (PMSF; dissolved in isopropanol; Sigma, cat. no. P7626)

10% (v/v) Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich, cat. no. I3021)

10% (w/v) sodium deoxycholate (DOC; Sigma, cat. no. D-6750)

Cycloheximide (CHX; Sigma, cat. no. C-7698)

Sucrose (Mallinckrodt, cat. no. 8360-04)

RNAseOUT (Invitrogen, cat. no. 100000840)

RPMI-1640 w/ L-glutamine (Cellgro, cat. no. 10-040-CV)

10% AlbuMAX I (w/v in sterile water) (Invitrogen, cat. no. 11020-039)

Gentamicin (Gibco, cat. no. 15750-060))

HT supplement (100x) (Invitrogen, cat. no. 11067030)

45% (w/v) sucrose (Sigma, cat no. G8769)

1 M HEPES buffer (Gibco, cat. no. 15630-080)

1x phosphate buffered saline (PBS; Cellgro, cat. no. 2109310CV)

Corning 500 ml vacuum filter flask (VWR, cat. no. 430769)

Glass slides (VWR, cat. no. 48311-702)

Giemsa stain (50X) (VWR, cat no. m708-01)

mirVana miRNA isolation kit (Ambion, ThermoFisher Scientific).

5' Biotin conjugated mature miRNA (sequence varies by miRNA of interest) (Dharmacon)

Biotin powder (Sigma-Aldrich)

1M Potassium Chloride

Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE Healthcare)

Ribosome resuspension buffer (see REAGENT SETUP)

Lysis buffer (see REAGENT SETUP)

15% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

50% (w/v) sucrose gradient solution (see REAGENT SETUP)

0.5 M sucrose cushion (see REAGENT SETUP)

60% (w/v) sucrose chase solution (see REAGENT SETUP)

Plasmodium cell culture media (see REAGENT SETUP)

RNA capture Wash Buffer (see REAGENT SETUP)

RNA Elution Buffer (see REAGENT SETUP)

REAGENT SETUP

Solutions

Plasmodium cell culture media

500 ml RPMI-1640 w/ L-glutamine

0.5 ml gentamicin

5 ml HT supplement

2.5 ml 45% glucose

25 ml 10% AlbuMAX I

12.5 ml 1 M HEPES

Sterile filter with 0.2 mm vacuum filter flask.

Plasmodium cell culture media containing 10x CHX

Same recipe as Plasmodium cell culture media above, with the addition of:

2 mM cycloheximide

Media is prepared as normal, then add CHX to a final concentration of 2 mM and filter.

1x PBS containing cycloheximide

Cycloheximide is added fresh to 1x PBS to a final concentration of 200 mM, and kept at 4 OC until use.

Ribosome resuspension buffer

400 mM potassium acetate

25 mM potassium HEPES, pH 7.2

15 mM magnesium acetate

200 mM cycloheximide (add fresh)

1 mM DTT (add fresh)

1 mM PMSF (add fresh)

40 U/ml RNaseOUT (add fresh)

Lysis buffer

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of:

1% (v/v) Igepal CA-630

0.5% (w/v) DOC

Sucrose solutions

Same recipe as ribosome resuspension buffer above, with the addition of varying amounts of sucrose:

15% (w/v) sucrose to make 15% sucrose gradient solution

50% (w/v) sucrose to make 50% sucrose gradient solution

0.5 M sucrose to make 0.5 M sucrose cushion

As above, cycloheximide, DTT, PMSF, and RNaseOUT must be added fresh.

The 60% sucrose chase solution requires only sucrose and water, no other components

60% (w/v) sucrose in DEPC-treated water to make 60% sucrose chase solution

RNA Capture Wash Buffer

20mM  KCl

5unit/ml Rnase Out (Invitrogen)

RNA Capture Elution Buffer

Same recipe as RNA Capture Wash Buffer, with the addition of:

2mM Biotin

EQUIPMENT

SW55 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 342194)

SW41 Ti ultracentrifuge rotor (Beckman, cat. no. 331362)

Ultra-ClearTM ½ x 2 in (13 x 51 mm) ultracentrifuge tubes for the SW55 (Beckman, cat. no. 344057)

Polyallomer 9/16 x 3 ½ in (14 x 89 mm) ultracentrifuge tubes for the SW41 (Beckman, cat. no. 331372)

L8-80M ultracentrifuge (Beckman)

Steel blunt syringe needle, 4 inch, 16G (Aldrich, cat. no. Z261378)

1 ml syringe with 27G½ needle (Becton Dickinson, cat no. 309623)

5 ml syringe (Becton Dickinson, cat. no. 309646)

Parafilm

Tube rotator, end-over-end

Microcentrifuge, refrigerated

Density gradient fractionation system (Teledyne Isco, cat. no. 69-3873-179)

TracerDAQ (Measurement Computing)

Eppendorf 5810R centrifuge

Eppendorf A-4-81 rotor (Eppendorf, cat. no. 022638807)