VDJ تسلسل: تحليل تسلسل عميق من سلسلة ترتيبها المناعي الثقيلة جين لكشف أنماط نسيلي تطور سرطان الغدد الليمفاوية B الخليوي
Summary
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Abstract
فهم قابلية التنسيل الورم أمر بالغ الأهمية لفهم الآليات التي تشارك في تكون الأورام وأمراض التقدم. بالإضافة إلى ذلك، فهم التغييرات تكوين نسيلي التي تحدث داخل الورم في الاستجابة لبعض البيئة الصغرى أو العلاجات قد تؤدي إلى تصميم نهج أكثر تطورا وفعالة للقضاء على الخلايا السرطانية. ومع ذلك، فقد كان الورم تتبع نسيلي سكان شبه صعبة نظرا لعدم وجود علامات مميزة. لمعالجة هذه المشكلة، تم إنشاء بروتوكول VDJ تسلسل لتتبع أنماط التطور نسيلي من منتشر كبير سرطان الغدد الليمفاوية الخلية B (DLBCL) الانتكاس من خلال استغلال VDJ إعادة التركيب والتحور الجسدية (SHM)، واثنين من ميزات فريدة من الأورام اللمفاوية الخلايا البائية.
في هذا البروتوكول، شيدت الجيل التالي من التسلسل (خ ع) مكتبات مع إمكانية فهرسة من تضخيم المناعي ترتيبها السلسلة الثقيلة (IGH) المنطقة VDJ من أزواج من التشخيص الأولي والانتكاس DLBCL عصيدةليه. على تم الحصول المتوسط أكثر من نصف مليون تسلسل VDJ في العينة بعد التسلسل، والتي تحتوي على كل VDJ إعادة ترتيب والمعلومات SHM. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير خطوط الأنابيب المعلوماتية الحيوية المخصصة للاستفادة الكاملة من المعلومات تسلسل لتوصيف IGH-VDJ ذخيرة داخل هذه العينات. وعلاوة على ذلك، فإن خط الأنابيب يسمح لإعادة الإعمار والمقارنة بين الهندسة المعمارية نسيلي الأورام الفردية، والتي تمكن الفحص من عدم التجانس نسيلي داخل الأورام التشخيص وخصم من أنماط التطور نسيلي بين التشخيص وأزواج الورم الانتكاس. عند تطبيق هذا التحليل على عدة أزواج التشخيص الانتكاس، وكشف لنا أدلة الرئيسي الذي أنماط تطورية الورم مميزة متعددة يمكن أن يؤدي إلى DLBCL الانتكاس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن توسيع هذا النهج في الجوانب السريرية الأخرى، مثل التعرف على المرض المتبقي الحد الأدنى، رصد التقدم المحرز الانتكاس والاستجابة للعلاج، والتحقيق في مأمن repertoirوفاق في سياقات غير سرطان الغدد الليمفاوية.
Introduction
السرطان هو مرض نسيلي. منذ ثلاثين عاما عندما اقترح بيتر C. نويل السرطان نسيلي نموذج التطور 1، وقد حاول العديد من الدراسات لتشريح السكان نسيلي داخل عينات الورم وإعادة التوسع والتطور أنماط نسيلي التي تكمن وراء عملية تكون الأورام 2. في الآونة الأخيرة، وقد مكن كامل الجينوم التسلسل المحققين إلى إلقاء نظرة عميقة على عدم التجانس نسيلي وتطور 3،4. ولكن نظرا لعدم وجود علامات الانقياد في العديد من أنواع الخلايا، فإنه من الصعب للاستدلال على العمارة نسيلي دقيقة والمسار التطوري. لحسن الحظ هناك علامة قابلية التنسيل الطبيعية في خلايا B الناضجة من فيه العديد من الأورام الخبيثة اللمفاوية، بما في ذلك DLBCL، تنشأ. وردا على التحفيز مستضد، ويمكن لكل خلية B تشكيل منتجة تسلسل IGH VDJ واحد من خلال الانضمام إلى H V (متغير)، وD (التنوع)، وJ H (الانضمام) قطعة معا من مجموعة كبيرة من هذه القطاعات. خلال هذه العلاقات العامةocess، وأجزاء صغيرة من التسلسل الأصلي قد يتم حذف ويمكن أن يضاف النيوكليوتيدات غير قالب إضافية لإنشاء VDJ إعادة ترتيب فريدة من نوعها. يمكن أن تكون موروثة هذا إعادة ترتيب VDJ محددة في كل ذرية من هذه الخلايا B، ومن ثم وضع علامات الفردية ناضجة B-الخلية ونتاجه 5. وعلاوة على ذلك، ويحدث SHM على تسلسل VDJ معاد في وسط جرثومي (GC) رد فعل لاحق لتقديم الطفرات إضافية لتوسيع تجمع الأضداد وتعزيز الأجسام المضادة تقارب 6. لذلك، من خلال مقارنة والمتناقضة VDJ وSHM أنماط عينات سرطان الغدد الليمفاوية التي خضعت هذه العمليات، يمكن أن يرسم داخل الورم عدم التجانس ويمكن استخلاصه مسار التطور نسيلي من المرض.
سابقا، يمكن تحديد VDJ إعادة ترتيب وSHM بواسطة PCR تضخيم المناطق معاد، استنساخ المنتجات PCR، وبعد ذلك سانجر التسلسل للحصول على معلومات التسلسل. هذا النهج طق منخفضة الإنتاجية والعائد المنخفض واسترجاع سوى جزء صغير جدا من كامل معاد ذخيرة VDJ، وتعيق توصيف التمثيل العام للسكان نسيلي ضمن عينة معينة. تم إنشاء نهج المعدلة عن طريق توليد NGS فهرسة المكتبات التسلسل من المنتجات VDJ PCR وأداء PE 2×150 بي بي التسلسل للحصول على أكثر من نصف مليون تسلسل VDJ معاد لكل عينة. بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير خط أنابيب مخصصة لأداء مراقبة الجودة (QC)، محاذاة، فلتر VDJ التسلسل يقرأ لتحديد إعادة ترتيب وSHMS كل قراءة، وإجراء تحليل النشوء والتطور على بنية نسيلي من كل عينة. بالإضافة إلى ذلك، تم تأسيس نهج جديد لمزيد من تميز وتطور أنماط نسيلي عن العينات التي تم جمعها في مختلف مراحل المرض.
لقد طبقت هذه التقنية لعينات المريض DLBCL. DLBCL هو شكل من اشكال عدوانية من سرطان الغدد الليمفاوية غير هودجكين مع الانتكاس المتكرر في ال تصل إلى واحدIRD من المرضى 7. الانتكاسات DLBCL عادة تحدث في وقت مبكر، في غضون 2-3 سنوات من التشخيص الأولي، على الرغم من أن البعض الآخر تحدث بعد 5 سنوات 8. تشخيص حالة المرضى انتكس والفقراء، مع 10٪ فقط نتوصل إلى 3 سنوات البقاء على قيد الحياة خالية من التقدم بسبب خيارات العلاج محدودة. وهذا هو الأساس للحاجة الملحة لمقاربات جديدة لعلاج DLBCL الانتكاس 9،10. ومع ذلك، الآليات الجزيئية المرتبطة DLBCL الانتكاس لا تزال مجهولة إلى حد كبير. بشكل خاص، دور التجانس نسيلي في التشخيص وتطور نسيلي خلال تطوير الانتكاس DLBCL هم uncharacterized في الوقت الحاضر، مما يجعل من الصعب تعريف العلامات البيولوجية دقيقة ومفيدة للتنبؤ الانتكاس. لمعالجة هذه المسائل، طبقنا نهجنا VDJ التسلسل في أزواج متعددة من مطابقة الأساسي التشخيص الانتكاس عينة DLBCL أزواج. ظهرت سيناريوهين التطورية نسيلي متميزة من الانتكاس من المقارنة بين أبنية نسيلي بين التشخيص وعصيدة الانتكاسليه توحي بأن الآليات الجزيئية متعددة يمكن أن تشارك في DLBCL الانتكاس.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لوجود عدد غير محدود تقريبا من تكرار المعلومات تسلسل مشفرة عن طريق VDJ إعادة ترتيب وSHM في موضع IGH من خلايا B الإنسان، أثبت الفحص للذخيرة IGH بالكامل عن طريق الإنتاجية العالية في أعماق التسلسل لتكون وسيلة فعالة وشاملة لتحديد نسيلي والسكان B-خلية فرعية نسيلي. وعلاوة على…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Materials
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6×1 L |
| 50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
Riferimenti
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
