VDJ-のSeq：B細胞リンパ腫のクローン進化のパターンを明らかに転位免疫グロブリン重鎖遺伝子のディープシーケンシング解析
Summary
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Abstract
腫瘍クローン性を理解することは、腫瘍形成および疾患の進行に関与するメカニズムを理解するために重要です。また、特定の微小環境または治療に反応して腫瘍内で発生するクローン組成変化を理解することは、腫瘍細胞を根絶するために、より洗練され、効果的なアプローチの設計につながる可能性があります。しかし、腫瘍クローンのサブ集団を追跡することは、識別可能なマーカーの欠如に挑戦しています。この問題に対処するために、VDJ-seqのプロトコルは、VDJ組換えおよび体細胞超変異（SHM）、B細胞リンパ腫の2つのユニークな機能を利用することにより、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）再発のクローン進化パターンを追跡するために作成されました。
このプロトコルでは、索引付けの可能性を秘めた次世代シーケンシング（NGS）ライブラリは、一次診断と再発DLBCL SAMPの組からの増幅された再配列免疫グロブリン重鎖（IgH遺伝子）VDJ地域から構築しましたレ。サンプルあたりの平均万人以上のVDJ配列は、VDJ再配列とSHM情報の両方が含まれているシーケンシング、後に得た上で。また、カスタマイズされたバイオインフォマティクスパイプラインは完全にこれらのサンプル内のIgH-VDJレパートリーの特徴付けのための配列情報を利用するために開発されました。また、パイプラインは、復興と診断腫瘍と診断し、再発腫瘍対間のクローン進化パターンの控除内クローン不均一性の検査を可能に個々の腫瘍のクローンアーキテクチャの比較を可能にします。いくつかの診断・再発のペアにこの分析を適用するとき、我々は、複数の特徴的な腫瘍の進化のパターンはDLBCLの再発につながることを重要な証拠を発見しました。さらに、このアプローチは、微小残存病変の同定、再発の進行および治療応答をモニターし、免疫repertoirの調査のような他の臨床面、に展開することができ非リンパ腫文脈におけるES。
Introduction
がんはクローン病です。ピーターC. Nowellが癌クローン進化モデル1を提案したときに30年前から、多くの研究は、腫瘍サンプル内のクローン集団を分析し、腫瘍形成プロセス2の根底にあるクローン拡大と進化パターンを再構築しようとしています。最近では、全ゲノム配列決定は、クローン異質と進化3,4で深く見てみるために研究者を可能にしました。しかし、多くの細胞型で扱いやすいマーカーの欠如に起因し、それは正確なクローンのアーキテクチャおよび進化の経路を推測することは困難です。幸いDLBCLを含む多くのリンパ系悪性腫瘍は、発信元の成熟B細胞における天然クローン性マーカーがあります。抗原刺激に応答して、これらのセグメントの大きなプールから一緒にセグメントを、各B細胞は、V H（可変）、D（多様性）を結合することによって、単一の生産のIgH VDJ配列を形成することができ、およびJ Hの （参加します）。このPRの間にocessは、元の配列の小さな部分を削除することができ、追加の非鋳型ヌクレオチドはユニークなVDJ再構成を作成するために添加されてもよいです。この特定のVDJ再配列は、したがって、個々の成熟B細胞およびその子孫5をタグ付け、このB細胞のすべての子孫に継承することができます。また、SHMは、抗体プールの拡大や抗体アフィニティー6の強化のための追加の突然変異を導入するために、その後の胚中心（GC）反応における再結合VDJ配列に発生します。したがって、比較し、これらのプロセスを経たリンパ腫サンプルのVDJ及びSHMパターンを対比することによって、腫瘍内の不均一性を描写することができ、疾患のクローン進化経路を推定することができます。
以前は、VDJ再構成とSHMのPCR産物をクローニングし、再結合領域を増幅するPCRによって同定することができ、配列情報を得るために、その後サンガー配列決定。このアプローチの私全体再結合VDJレパートリーのごく小さな部分を取得し、与えられたサンプル中のクローン集団の全体的な表現の特性を妨げ、低スループットと低収量です。修正されたアプローチは、VDJ PCR産物からNGSインデックスさシーケンシングライブラリーを作製し、サンプルあたり万人以上の組換えVDJ配列を得るために、PE 2×150 bpの塩基配列決定を行うことによって作成されました。また、カスタムパイプラインは、フィルタVDJ配列決定は、各リードの再配置とSHMSを識別し、各サンプルのクローンアーキテクチャに系統学的解析を実行するために読み出して、品質管理（QC）を行う位置合わせするために開発されました。また、新たなアプローチは、さらに、様々な病期で収集したサンプルについて、クローン進化パターンを特徴付けるために確立されています。
私たちは、DLBCL患者試料にこの手法を適用しています。 DLBCLは、1回目までに頻繁に再発と非ホジキンリンパ腫の積極的な形であります患者7のIRD。いくつかは、5年8後に発生するんがDLBCLの再発は、通常、最初の診断の2〜3年以内に、早期に発生します。再発患者の予後は10％だけが原因限られた治療選択肢に3年無増悪生存率を達成することで、不良です。これは、DLBCLの再発9,10を治療するための新規なアプローチが緊急に必要に基礎です。しかし、DLBCLの再発に関連する分子メカニズムはまだ不明な点が多いです。特に、DLBCLの再発の開発中に診断し、クローン進化でクローン異質の役割は、それが困難な再発を予測するために、正確かつ有用なバイオマーカーを定義すること、現在特徴付けられていないです。これらの質問に対処するために、我々は一致した一次診断、再発DLBCLサンプルのペアの複数のペアに私たちのVDJシーケンシングアプローチを適用しました。再発2つの異なるクローン進化のシナリオは、診断と再発SAMPの間にクローンアーキテクチャの比較から登場しましたレ複数の分子機構は、DLBCLの再発に関与する可能性があることを示唆しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
そのため、ヒトB細胞のIGH遺伝子座にVDJ再配列とSHMによってコード化された配列情報の反復のほぼ無制限の数の、ハイスループットディープシークエンシングにより全体IGHレパートリーの検査は、クローン描写するための効率的かつ包括的な方法であることが判明しましたサブクローン性B細胞集団。さらに、この方法は、疾患の種々の段階に沿って収集された患者サンプルのクローンおよび?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Materials
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6×1 L |
| 50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
Riferimenti
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