VDJ-Seq: Deep sekvenseringsanalys av omarrangerade immunoglobulin tung kedja Gene att avslöja Klon Evolution Mönster för B-cellslymfom
Summary
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Abstract
Förståelse tumör clonality är avgörande för att förstå de mekanismer som är involverade i tumörbildning och sjukdomsprogress. Dessutom kan förstå de klonala sammansättning förändringar som sker inom en tumör som svar på vissa mikromiljön eller behandlingar leda till utformningen av mer sofistikerade och effektiva metoder för att utrota tumörceller. Har dock spåra tumör klonala delpopulationer varit utmanande på grund av bristen på urskiljbara markörer. För att lösa detta problem, var en VDJ-punkter protokoll skapas för att spåra klonala evolution mönster diffusa storcelliga B-cellslymfom (DLBCL) återfall genom att utnyttja VDJ rekombination och somatisk hypermutation (SHM), två unika egenskaperna hos B-cellslymfom.
I detta protokoll, var nästa generations sekvensering (NGS) bibliotek med indexerings potential tillverkad av förstärkt rearrangerade immunoglobulin tung kedja (IgH) VDJ regionen från par av primär diagnos och återfall DLBCL samples. I genomsnitt mer än en halv miljon VDJ-sekvenser per prov erhölls efter sekvensering, som innehåller både VDJ rearrangemang och SHM information. Dessutom har anpassade bioinformatik rörledningar utvecklats till fullo utnyttja sekvensinformation för karakterisering av IgH-VDJ repertoar inom dessa prover. Dessutom tillåter rörledningen återuppbyggnad och jämförelse av klon arkitektur enskilda tumörer, vilket möjliggör en undersökning av klon heterogenitet inom diagnos tumörer och avdrag för klonala evolution mönster mellan diagnos och återfall tumör par. Vid tillämpning av denna analys till flera diagnos återfall par, avslöjade vi nyckel bevis för att flera distinkta tumör evolutionära mönster kan leda till DLBCL återfall. Dessutom kan utökas detta synsätt i andra kliniska aspekter, såsom identifiering av minimal kvarvarande sjukdom, övervakning återfall framsteg och behandlingssvar, och utredning av immun repertoares i icke-lymfom sammanhang.
Introduction
Cancer är en klonal sjukdom. Sedan trettio år sedan när Peter C. Nowell föreslog cancer klon evolution modell 1, har många studier försökt dissekera klonala populationer inom tumörprover och rekonstruera klonal expansion och evolution mönster som ligger till grund för tumörbildning processen 2. Nyligen har hela-genomet sekvensering möjlig utredarna att ta ett djupt titt på klon heterogenitet och evolution 3,4. Men på grund av bristen på lätthanterliga markörer i många celltyper, är det svårt att sluta sig till den exakta klonal arkitektur och utvecklingsväg. Lyckligtvis finns det en naturlig clonality markör i mogna B-celler från vilka många lymfoida maligniteter, inklusive DLBCL, har sitt ursprung. Som svar på antigenstimulering, kan varje B-cell bildar en enda produktiv IgH VDJ-sekvens genom att gå en Vh (variabel), en D (mångfald) och JH (sammanfogning) segment tillsammans från en stor pool av dessa segment. Under denna process, kan små delar av den ursprungliga sekvensen tas bort och ytterligare icke-styrd nukleotider får tillsättas för att skapa en unik VDJ ombildning. Denna specifika VDJ ombildning kan ärvas i alla avkomman av detta B-cell, därför märka individuella mogna B-cellen och dess avkomma 5. Dessutom förekommer SHM på rekombinerade VDJ-sekvenser i den efterföljande germinal center (GC) reaktion att införa ytterligare mutationer för utbyggnad av antikroppen poolen och förbättring av antikroppsaffinitet 6. Därför, genom att jämföra och kontrastera VDJ och SHM mönster lymfom prover som har genomgått dessa processer inom tumör heterogenitet kan avgränsas och klon evolution väg av sjukdomen kan härledas.
Tidigare kunde VDJ ombildning och SHM identifieras genom PCR förstärka de rekombinerade regionerna kloning av PCR-produkter, och därefter Sanger-sekvensering för att erhålla sekvensinformation. Detta tillvägagångssätt is låg genomströmning och lågt utbyte, hämta endast en mycket liten del av hela den rekombinerade VDJ-repertoar, och hindrar karakteriseringen av den totala representationen av den klonala populationen inom ett givet prov. En modifierad metod skapades genom att generera NGS indexerade sekvense bibliotek från VDJ PCR-produkter och utför PE 2×150 bp sekvensering för att få mer än en halv miljon rekombinerade VDJ-sekvenser per prov. Dessutom har en egen pipeline utvecklats för att utföra kvalitetskontroll (QC), justera, filter VDJ sekvense läser att identifiera rearrangemang och SHMS varje läsning, och utföra fylogenetiska analys av klon arkitektur varje prov. Dessutom har en ny metod har upprättats för att ytterligare karakterisera klonala evolution mönster för prover som tagits vid olika sjukdomsstadier.
Vi har tillämpat denna teknik för att DLBCL patientprover. DLBCL är en aggressiv form av non-Hodgkin lymfom med täta återfall i upp till en eIRD av patienterna 7. DLBCL återfall inträffar normalt tidigt, inom två till tre år av den första diagnosen, även om vissa uppstår efter 5 år 8. Prognos för återfall patienter är dålig, med endast 10% att uppnå 3 års progressionsfri överlevnad på grund av begränsade behandlingsalternativ. Detta är grunden till det akuta behovet av nya metoder för att behandla DLBCL återfall 9,10. Men molekylära mekanismer i samband med DLBCL återfall är fortfarande till stor del okända. I synnerhet den roll som klonal heterogenitet vid diagnos och klon utveckling under DLBCL återfall utveckling är för närvarande uncharacterized, vilket gör det svårt att definiera en korrekt och användbar biomarkör för att förutsäga återfall. För att ta itu med dessa frågor, tillämpade vi vår VDJ-sekvense strategi på flera par av matchade primär diagnos-återfall DLBCL provpar. Två distinkta klon evolutionära scenarier för återfall uppstått ur jämförelsen av de klonala arkitekturer mellan diagnos och återfall samples som föreslår flera molekylära mekanismer kan vara inblandade i DLBCL återfall.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund av det nästan obegränsat antal iterationer av sekvensinformation kodas av VDJ ombildning och SHM på IGH platsen för humana B-celler, undersökning av hela IGH repertoaren av hög genomströmning djupt sekvensering visade sig vara ett effektivt och heltäckande sätt att avgränsa klonal och sub-klon B-cellpopulationer. Dessutom kan denna strategi kan användas för att studera klonal evolution väg B-celltumörutveckling, remission, och återfall genom att jämföra klonala och sub-klon arkitekturer av pat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Materials
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6×1 L |
| 50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
Riferimenti
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
