Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain

Summary

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Abstract

Cultures organotypiques permettent la reconstitution d'un environnement 3D critique pour les interactions de contact cellule-cellule et de cellule-matrice qui imite la fonction et la physiologie de leurs homologues in vivo de tissus. Ceci est illustré par des cultures organotypiques de peau qui récapitule fidèlement la différenciation épidermique et le programme de stratification. Kératinocytes primaires épidermiques humains sont génétiquement manipulable par rétrovirus où les gènes peuvent être facilement surexprimés ou renversé. Ces kératinocytes génétiquement modifiées peuvent ensuite être utilisés pour régénérer l'épiderme humain dans des cultures organotypiques de peau qui fournissent un modèle puissant pour étudier les voies génétiques croissance épidermique d'impact, la différenciation et la progression de la maladie. Les protocoles présentés ici décrivent des procédés pour préparer de derme humains dévitalisés ainsi que pour manipuler génétiquement les kératinocytes humains primaires afin de générer des cultures organotypiques de peau. La peau humaine régénéré peut être utilisé dans downstrEAM applications telles que le profilage de l'expression génique, une immunocoloration, des immunoprécipitations et de chromatine suivie de séquençage à haut débit. Ainsi, la production de ces cultures organotypiques de peau génétiquement modifiés permettra à la détermination des gènes qui sont essentiels pour le maintien de l'homéostasie de la peau.

Introduction

L'épiderme humain est un épithélium stratifié qui se connecte au derme sous-jacent à travers une matrice extracellulaire connu comme l'épiderme zone.The de la membrane basale sert non seulement une barrière imperméable pour empêcher la perte d'humidité, mais aussi en tant que première ligne de défense pour protéger le le corps des substances étrangères et toxiques ^1. La couche de base, qui est la couche la plus profonde de l'épiderme, les cellules épidermique contient souches et progénitrices qui donnent lieu à la descendance différenciée qui forment le reste de l'épiderme ^2. Comme les cellules progénitrices de l'épiderme se différencient de leur migration vers le haut pour former la première couche de cellules différenciées connu que la couche épineuse ^3. Dans la couche épineuse, les cellules tournent sur l'expression de kératines 1 et 10, qui fournit alors la force de résister à une contrainte physique pour les couches différenciées de l'épiderme. Comme les cellules de la couche épineuses se différencient en outre, ils se déplacent vers le haut dans l'épiderme à dem la couche granulaire qui est caractérisée par la formation de granules de kératohyaline et lamellaires ainsi que des protéines de structure qui sont assemblés en dessous de la membrane plasmique. Comme les cellules passent dans le processus de différenciation, les protéines sous la membrane de plasma sont réticulés les uns aux autres, tandis que les granulés sont extrudés lamellaires à partir des cellules pour former une barrière lipidique riche appelée stratum corneum ^4.

Les maladies qui impliquent des altérations de croissance épidermique et de l'impact de la différenciation de ~ 20% de la population ^5. Ainsi, la compréhension des mécanismes de ce processus est d'une grande importance. Depuis manifestation de plusieurs de ces maladies est subordonnée à cellule-cellule ou cellule-matrice de contact, cultures organotypiques où l'épiderme humain est reconstitué dans un environnement 3D ont été créés ^6-10. Ces procédés impliquent typiquement l'utilisation de kératinocytes primaires ou transformées ensemencées sur la matrice extracellulaire telles que les humains dévitalisésderme, Matrigel, le collagène ou.

Pour comprendre les mécanismes de régulation des gènes qui sont importants pour la croissance et la différenciation de l'épiderme, les kératinocytes peuvent être manipulées génétiquement par des vecteurs rétroviraux pour surexprimer des gènes knockdown ou en culture 2D et ensuite reconstitués en 3D. Ces méthodes ont été largement utilisées pour caractériser les gènes impliqués dans l'épiderme souches et cellules progénitrices auto-renouvellement et de différenciation ainsi que la progression de la néoplasie ^11-21. Ici, un protocole en profondeur sur la façon de modifier l'expression génique dans des cultures organotypiques épidermiques par l'utilisation de retrovirus est fourni.

Protocol

Le protocole de la peau humaine a été réalisée en conformité avec les directives de l'Université de Californie, Comité d'éthique de la recherche de San Diego. La peau humaine peut être obtenue à partir d'échantillons chirurgicaux jetés ou achetés auprès des banques de la peau (banque de peau est listé dans la table Matériel / Equipement). L'endroit où la peau est dérivée de ou âge du donneur est pas critique pour l'expérience, tant que les proté…

Representative Results

La première étape dans la génération de la peau humaine organotypique est d'enlever l'épiderme du derme. Le 2 semaines d'incubation de la peau à 37 ° C dans 4 x pen / strep / PBS devrait permettre la séparation du derme de l'épiderme (figure 1A). Si la séparation des épiderme et le derme est difficile puis placez le tissu à 37 ° C en 4x stylo / streptocoque / PBS pendant une semaine et puis essayer de nouveau pelage en utilisant une pince. Une de…

Discussion

La manipulation génétique dans la peau humaine cultures organotypiques offrent de nombreux avantages à couramment étudié 2D cellules cultivées ainsi que des modèles de souris. Cultures 2D pas les trois dimensions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire interactions trouvés dans les tissus et organes intacts. Des études récentes ont également trouvé d'énormes différences entre les cellules de cancer de la peau en culture 2D et 3D avec les cellules cultivées en 3D montrant beaucoup plus de si…

Materials

Human skin	New York Firefighters Skin Bank	http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP	GIBCO	15140-122
amphotropic phoenix cell lines	ATCC	CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent	Promega	E2691
Keratinocyte Media (KCSFM)	Life Technologies	17005042
DMEM	GIBCO	11995
Ham's F12	Cambrex	12-615F
FBS	GIBCO	10437-028
Adenine	Sigma	A-9795
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Hydrocortisone	Calbiochem	3896
Insulin	Sigma	I-1882
EGF	Invitrogen	13247-051
Transferrin	Sigma	T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride	Serologicals	89-001-1
cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Matrigel	Corning	354234
Keratin 1 antibody	Biolegend	PRB-149P
square pegs	Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
human neonatal keratinocytes	Cell Applications	102K-05n
MSCV retroviral vector	Clontech	634401
LZRS retroviral vector	Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector	Oligoengine	VEC-PRT-0002
hexadimethrine bromide	Sigma	H9268-5G