The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.
Organotipik kültürlerinin fonksiyonu ve di vivo doku meslektaşları fizyolojisini taklit hücre-hücre teması ve hücre-matriks etkileşimlerinin önemli bir 3 boyutlu bir ortamda tekrar oluşturulmasını sağlar. Bu sadakatle epidermal farklılaşma ve tabakalaşma programı özetlediği Organotipik cilt kültürler tarafından örneklenmiştir. Birincil insan epidermal keratinositler genleri kolayca aşırı veya aşağı çalınabilecek retrovirüslere yoluyla genetik olarak manipüle vardır. Bu genetik olarak değiştirilmiş keratinositler daha sonra genetik yollar, darbe epidermal büyüme farklılaşmasını ve hastalığın ilerlemesini araştırmak için güçlü bir model sağlanması Organotipik bir deri kültürlerinde, insan epidermisi yeniden oluşturmak için kullanılabilmektedir. Burada sunulan protokoller cansız insan dermiş hazırlanması hem de genetik olarak Organotipik bir deri kültürü oluşturmak için primer insan keratinositleri işlemek için yöntemleri tarif eder. Rejenere insan deri downstr kullanılabilirBöyle gen ifade profilleme, immün ve yüksek verimlilik sıralaması takip kromatin İmmüno olarak eam uygulamaları. Bu nedenle, bu genetik olarak değiştirilmiş organotipik cilt kültürlerin nesil cilt dengesini sağlamaya yönelik kritik genlerin belirlenmesini sağlayacaktır.
İnsan üst deri değil, aynı zamanda korumak için savunma bir birinci hattı olarak nem kaybını önlemek için sızdırmaz bir bariyer olarak hizmet eder bazal membran zone.The epidermis olarak bilinen hücre dışı bir matris boyunca yatan dermiş bağlanan bir tabakalı epitelyumdur yabancı ve zehirli maddelerden 1 vücut. Epidermisin derin katmanı bazal tabaka, epidermis 2 kalanını oluşturan farklılaşmış döl doğuran epidermal kök ve progenitör hücreler içerir. Epidermal progenitör hücrelerin ayırt olarak bunlar Spinoz tabakanın 3 olarak da bilinir farklılaşmış hücrelerin birinci tabakayı oluşturmak üzere yukarı doğru göç eder. Spinöz katmanda, hücreler daha sonra epidermis farklılaşmış katmanları fiziksel strese dayanma gücünü sağlayan keratinlerden 1 ve 10 ifadesi, açın. Spinöz tabaka hücreleri daha farklılaştırmak, onlar için epidermisin yukarı hareketplazma zarı altına monte edilir keratohyalin ve lameller granül oluşumunun yanı sıra, yapısal proteinlerin karakterize granüler tabaka m. Hücreler farklılaşma sürecinde devam ederken katmanlı granüller zengin koruyucu stratum corneum adı verilen bir lipidi 4 oluşturmak için hücreler ekstrüde edilirken, plazma membranı altından proteinleri birbirine çapraz bağlı bulunmaktadır.
Epidermal büyüme ve farklılaşma etkisi ~ nüfusun 5% 20 değişiklikleri içeren hastalıklar. Bu durumda, bu işlemin mekanizmalarının anlaşılması önem taşımaktadır. Bu hastalıkların birçoğu tezahürü hücre-hücre veya hücre-matris temas etmesine bağlıdır, insanın epidermisin 3 boyutlu bir ortamda yeniden oluşturulur Organotipik kültürler 6-10 oluşturuldu. Bu yöntemler, tipik olarak, cansız insan gibi hücre dışı matrisin üzerine ekildi primer ya da dönüştürülmüş keratinositlerin kullanılmasını içerirDermiş, Matrigel veya kollajen.
Epidermal büyüme ve farklılaşmasında önemli bir gen düzenleyici mekanizmaların anlaşılması, genetik olarak keratinositler 2B kültür genleri demonte veya aşın ifade etmek üzere retroviral vektörler ile işlenmesi ve sonra 3D içinde yeniden edilebilir. Bu yöntemler, neoplazi 11-21 epidermal kök ve projenitör hücre kendini yenileme ve farklılaşma gibi ilerlemesinde rol oynayan genleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, retrovirüsler kullanımı yoluyla epidermal organotipik kültürlerinin gen ekspresyonunu değiştirmek için nasıl derinlemesine bir protokolü temin edilmektedir.
Organotipik kültürler birçok avantaj sunan insan derisinde Genetik manipülasyon yaygın 2B kültür hücreleri yanı sıra fare modelleri okudu etmek. 2B kültürleri sağlam organ ve dokularda bulunan üç boyutlu bir hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris etkileşimlerine yoksundur. Son çalışmalar da 16 tümörler birincil insan derisine çok daha fazla gen ifadesi benzerlikleri gösteren 3D kültür hücreleri ile 2D ve 3D kültür cilt kanseri hücreleri arasındaki muazzam farklar bulduk. ?…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Amerikan Kanser Derneği Araştırma Scholars Grant (RSG-12-148-01-DDC) ve CIRM Temel Biyoloji Ödülü (RB4-05779) supportedby oldu.
Human skin | New York Firefighters Skin Bank | http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html |
PEN/STREP | GIBCO | 15140-122 |
amphotropic phoenix cell lines | ATCC | CRL-3213 |
FUGENE 6 transfection reagent | Promega | E2691 |
Keratinocyte Media (KCSFM) | Life Technologies | 17005042 |
DMEM | GIBCO | 11995 |
Ham's F12 | Cambrex | 12-615F |
FBS | GIBCO | 10437-028 |
Adenine | Sigma | A-9795 |
Cholera Toxin | Sigma | C-8052 |
Hydrocortisone | Calbiochem | 3896 |
Insulin | Sigma | I-1882 |
EGF | Invitrogen | 13247-051 |
Transferrin | Sigma | T-0665 |
Ciprofloxacin Hydrochloride | Serologicals | 89-001-1 |
cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 |
Matrigel | Corning | 354234 |
Keratin 1 antibody | Biolegend | PRB-149P |
square pegs | Arts and crafts stores | |
human neonatal keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 |
human neonatal keratinocytes | Cell Applications | 102K-05n |
MSCV retroviral vector | Clontech | 634401 |
LZRS retroviral vector | Addgene | |
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector | Oligoengine | VEC-PRT-0002 |
hexadimethrine bromide | Sigma | H9268-5G |