This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
Optogenetic fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (ofMRI) genelinde hücre tipine özgü fonksiyonel nöral devrelerin haritalama ve onların dinamiklerini sağlayan optogenetic stimülasyon 1-11,38 hassasiyetle yüksek alan fMRI uzaysal çözünürlüğü birleştiren yeni bir tekniktir beyin. spesifik hücre tipleri ışık duyarlı membran ötesi iletkenliğini kanal adı verilen opsins sokulmasıyla uyarılması için hedef için optogenetics sağlar. Nöral devrelerin belirli unsurları genetik bozulmamış beyin 1-15 faaliyet milisaniye-zaman ölçeğini modülasyonu sağlayan, bu kanalları ifade etmek değiştirilir. fMRI nöronal aktivitenin dolaylı bir ölçüm sağlar, kan oksijen seviyesi bağımlı (BOLD) sinyal 16-18 ölçümü yoluyla belirli nöral devrelerin optogenetic uyarılması beynin küresel dinamik tepki belirlenmesi non-invaziv bir yöntem sağlar.
nispeten yüksek uzaysal çözünürlükte tüm beynin bir görünüm sağlayabilir, çünkü bu iki tekniğin kombinasyonu, optogenetic fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (ofMRI) olarak adlandırılan, örneğin elektrofizyoloji olarak uyarılması sırasında kayıt beyin aktivitesinin diğer yöntemlere göre avantajlıdır. Bu invaziv kayıt elektrotları 1-11 implantasyonu için gerek kalmadan uyarım bölgesinden uzak mesafelerde hedef uyarılmasına tepki olarak nöronal aktivitenin tespit edilmesini sağlar. ofMRI elektrotun yakın farklı hücre tiplerini işe ve böylece her nüfus 19 nedensel etkisi bulandırabilir fMRI sırasında elektrik stimülasyonu gerçekleştirme daha geleneksel yöntem üzerinde avantajlıdır. Buna ek olarak, elektrotlar elektrik stimülasyonu için kullanılan ve oluşturulan akım MR 20 sırasında eserler üretebilir. Nitekim, ofMRI belirli modulati küresel beyin aktivitesi üzerine etkisi gözlem sağlarBu tür transgenik hayvanlarda Cre-lox sistemi ya da promotörlerin kullanılması gibi gelişmiş bir genetik hedefleme teknikleri kullanılarak hücre tipleri çok çeşitli ilgili. tüm beyin izleme kombinatoryal optik kontrol özel hücre tipleri uyarmak için önleyen ve ChR2 hem NpHR kullanılarak ofMRI ile mümkündür. ofMRI kullanıma hazır Optogenetic araç takımı, aynı zamanda hızlı bir şekilde implante elyaf gerekliliğini ortadan olabilir stabilize basamak fonksiyonu opsins (SSFOs) veya kırmızı-kaydırılmış opsins arasında artan ışık hassasiyeti ya da geliştirilmiş kinetiği ile opsins tanıtımıyla zamanla gelişmektedir görüntüleme 21 sırasında non-invaziv stimülasyon sağlayan optik,. Bu olasılıklar elektrik stimülasyonu ile kullanılamaz.
Bununla birlikte, beyin ışık teslimat doku ısıtmadan elde edilen sinyal eserler gevşeme sürelerine sıcaklığı kaynaklı modifikasyon pseu üretmek için gösterilmiştir 22, rapor edilmiştiraktivasyonu yapmak. ofMRI performans Araştırmacılar, bu nedenle bu potansiyel yıkmak farkında olmalıdır. Doğru kurulum ve kontroller ile, konu ele alınabilir. Buna ek olarak, fMRI'da hemodinamik yanıtı ölçmek için, nispeten düşük zamansal çözünürlüğü bu tekniğin bazı uygulamalar için sınırlayıcı bir faktör olabilir.
Bu protokol, ilk derin in vivo beyin içine ışığın belirli dalga boyuna sahip verilmesini sağlamak fiber optik implant yapımını da tarif eder. protokol daha sonra stereotaktik cerrahi ile kesin bir beyin bölgesine opsin kodlama viral vektör teslim tarif eder. protokolü Sonraki eşzamanlı ışık uyarılması sırasında tüm beyin fonksiyonel MRI işlemi anlatılmaktadır. Son olarak, protokol elde edilen verilerin temel veri analizini özetlemektedir.
Unutmayın ki, burada açıklanan optogenetics ışık teslimat için kronik bir implant gerektirir. Ancak, fiber optik implantlar kararlı ve biyo vardıruyumlu bir uzunlamasına tarama ve ay 23,24 bir süre boyunca sinir devresi araştırılması için izin.
Özet olarak, hassas uyarılması ve ofMRI bütün beyin izleme yeteneği beyin connectomics çalışma için güçlü bir araç ofMRI yapımında önemli faktörlerdir. Buna ek olarak, farklı hayvan modellerinde ile birleştiğinde nörolojik hastalıklar 25 mekanizmalarına yeni fikir verebilir. Nitekim, ofMRI nöbet 8 ile ilişkili farklı hipokampal alt bölgelerin ağ etkinliğini aydınlatmak için kullanılır olmuştur. Bu nedenle, sistem düzeyinde sinirbilim soruları yanıtlayan ilgilenen laboratuarlar önem bu tekniği bulacaksınız.
görüntüleme sırasında konunun hareket veri bozulmasına yol açabilir dışlayıcı önemli bir kaynağıdır. Uygun şekilde uygun anestezi düzeylerini korumak olacak gibi eserler en aza indirebilirsiniz görüntüleme beşiği hayvan güvence. Burada, izofluran ancak medetomidin ya ketamin ve ksilazin gibi alternatif anestezikler, kullanılan da dikkate alınmalıdır. Bununla birlikte, anestezinin seviyeleri ve seçimi KALIN karşılık 28 de dahil olmak üzere, beyinde birçok parametre etkileyebilir. Izofluran nöronal eksitabilite 29 değişikliklere neden olabilir. Diğer anestezikler da GABA sinaptik inhibisyon 30 etkileyebilir. ofMRI nöronal aktivitenin etkileme kabiliyetini verilen gerçekleştirilmesi Böylece, anestezi seçimi önemlidir. anestezi olmadan ofMRI mümkündür hayvansal alışkanlık ise azaltılabilir hayvan, artan hareketi ile zor olabilir; Böyle uyanık ofMRI çalışmaları daha önceden yapılmıştır birnd beyinde 9,10 anestezi karıştırıcı etkisini önlemek olacaktır. Post-processing hareket düzeltme algoritmaları büyük ölçüde hareket etkilerini azaltmak için kullanılabilir. Bu yöntemlerin bazıları düzeltme altında kareler maliyet referans görüntü fonksiyonu ve görüntü toplamını minimize Bu protokol, istihdam ters Gauss-Newton algoritması dahil, mevcuttur. Bu işlem sürelerini 27 azaltmak için GPU paralel platformu tasarımı kullanılarak, hızlı ve sağlam hareket düzeltme sağlar çünkü algoritma yararlıdır.
Bu protokolde veri yeniden inşası için, MATLAB ortamında özel yazılmış yazılım spiral örnekleri Gridlenmiş görüntülere 31-33 içine k-uzayda yeniden iki boyutlu gridding yeniden inşası için kullanılmıştır. Zaman serisi verileri stimülasyon öncesi toplanan bazal süre için her voksel nisbetle KALIN sinyalinin yüzdesi modülasyonu hesaplanmak suretiyle meydana çıkartılmıştır. kimin zaman serileri voksellerini syn edildiaktif vokseller olarak tanımlandı 0.35 ya da daha büyük bir tutarlılık değeri Optogenetic stimülasyon blok chronized; Bu tutarlılık değeri en az 10 -9 P değeri 8'e karşılık gelir. Fourier büyüklüğü tüm frekans bileşenlerinin 8,27 toplamı-of-kareler bölünmesiyle tekrarlanan stimülasyon döngülerinin frekansta dönüşümü tutarlılık değerleri hesaplanmıştır. Familywise hatası çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni düzeltmesi ile kontrol edilebilir. Analiz alternatif yöntemler, genel doğrusal modeller (GLMs) olarak parametrik istatistiksel testler de dahil olmak üzere, kullanılabilir. tutarlılık yöntemi, geleneksel genel doğrusal modele kıyasla İHÖ'ye az ön bilgi gerektirir. ofMRI kullanarak veri araştırma, bu nedenle, avantajlıdır. Bununla birlikte, tutarlılık yöntemi yalnızca aralığı interstimulus sabit ve diğer etkinlik iliflkilerimiz ile ofMRI veri kullanılamaz olan olay ile ilgili tasarımları blok tasarımları veri için kullanılabilir veya seçilebilirted tasarımları veya karışık tasarımlar. Daha sonra, dinamik nedensel modelleme (DCM) ofMRI ile tespit beyin bölgeleri arasında etkileşimler analiz etmek için kullanılabilir. DCM fMRI 34 sırasında deneysel girişlere sistem yanıtları fonksiyonel bağlantı analizi için geliştirilmiş bir Bayes istatistiksel tekniktir.
ofMRI için ek teknik kaygılar burada tartışılır. İmplantlar hasarlı veya çalışma etkilenen hayvan kaldırılmasına yol düşmek olabilir. Yeniden implantasyon ameliyatı nedeniyle hayvan refahı konularında özgün implantasyon cerrahisi gibi ve yine aynı ROI hedefleyen ek belirsizlik tavsiye edilmez. Çünkü her bir hayvan deneğe için harcanan zaman ve kaynak önemli miktarda malzemenin mukavemetinin dikkate ofMRI çalışmalarda kullanım için uygun bir diş çimento tercih önemli bir husustur. implantasyon cerrahisi implan uzun ömürlü maksimize kritik bir faktördürt ve hayvan konu. Örneğin, kafatası çalışma sırasında hayvanın potansiyel aylarca süren bir zaman çizelgesi üzerinde istikrarı sağlamak için seramik halka implantın etrafında çimento yeterli miktarda diş çimento uygulamadan ve yerleştirmeden önce kuru olması sağlanmış. Buna ek olarak, alternatif kafes tasarımları araştırdı ve sık sık kafes içine çıkıntı tel yiyecek tutan üstleri ve su ile kafesleri önlemek ve implant zarar hayvan için fırsatlar sağlamak için yerel hayvan bakım tesisi ile ele alınabilir. Önemlisi, diş çimento görüntüleme ve alternatif çimentolar hayvan deneylerinde kullanılmadan önce bir tarayıcı bir hayalet ve görüntüleme üzerine uygulama ile test edilebilir etkileyen eserler azaltmak için dikkatle seçilmelidir. çeşitli simanların ile deneme yanılma Bu protokolde kullanılan çimento görece az sayıda eserler verdiğini göstermiştir. ofMRI gerçekleştirmede başka teknik zorluk extr verilen, amaçlanan ROI fiber optik yerleştirme doğruluğubeyin 35 çekirdekleri arasında var olabilir Emely küçük mesafelerde. implantasyon ameliyatı tamamladıktan sonra, T2 ağırlıklı anatomik taramaları beyin atlası üzerine kaplayan doğru yerleştirme belirlemek için kullanılabilir. cerrah ve bu cerrahisine uygulama becerisi doğru yerleştirme oranlarını artırabilir. amaçlanan ROI özgünlüğü ve opsin ifadesi hayvan perfüze ve beyin sabitleme, immünhistokimya veya görselleştirme opsin etiketli bir muhabir-proteinin endojen floresan kullanarak çalışmanın sonuca doğrulanabilir. Bu haberci proteinleri de opsin istenen nöronal hücre tipleri 1,8,15,25 ifade sağlamak için başka proteinler ile birlikte lokalize edilebilir. Daha önce de belirtildiği gibi hafif teslim 22 nedeniyle doku ısıtma ofMRI yaparken, eserler ortaya çıkabilir. Doku ısıtma yanlış BOLD sinyal sonuçlanan gevşeme süreleri değişiklik neden olur. Bu ac sağlamak içinofMRI sırasında ışık uyarılmasından kaynaklanan tivation Bu yapıyı bağlı değildir, opsin-negatif kontroller (örneğin, AAV-CaMKIIa-EYFP gibi) kontrol florofor vektörleri ile enjekte salin enjekte edilmiş hayvanların veya hayvanlarda ofMRI tabi yapılmalıdır. Ayrıca, iyi bir ışık iletim verimliliği ile iyi yapılmış fiber optik implantlar yüksek lazer yetkileri kullanmak gerek kaldırmak için kullanılmalıdır. ofMRI çalışmaları nedeniyle doku ısıtma da yanlış aktivasyon gerçekleştirilmiştir bir sorun 1,6-8,10,11 olmamıştır.
ekspresyon için nöronları gerekli Optogenetic genlerin sokulması için de vektörün seçimi ile ilgili olarak, AAVler insanlarda hastalığa neden olduğu bilinmektedir ve bu nedenle, uygun bir seçenek, bu maddeler (BSL-1) kullanmak için gerekli düşük biyo-güvenlik seviyesi verilmez. Buna ek olarak, vektör çekirdeklerinin çok sayıda stok ve çoklu serotipleri ile çeşitli optogenetic genler ile paketlenmiş AAVS taşırlar. AAV serotip B seçilmelidirOptimal ifade seviyelerini 36,37 sağlamak amacıyla hücre popülasyonu hedef ased. Lentiviruses da kullanılabilir, ancak daha yüksek bir biyogüvenlik düzeyi gerektirir edilebilir. Optogenetic genlerin yeterli ifadesi için gerekli olan zaman süresi, kullanılan özel AAV ve spesifik deneysel paradigmasında, kullanılan özel hayvan modeline bağlı olarak değişkendir. Bu protokol, 11 haftalıkken Sprague Dawley sıçanları kullanılmıştır ve optogenetic çalışmalar virüs enjeksiyonundan sonra dört ila altı hafta başlayacak. Transgenik fareler, Optogenetic çalışmalarda kullanılabilir. Opsins yeterli ekspresyonu için gerekli zaman miktarının saptanması pilot deneyleri için gereklidir. Stimülasyon paradigmaları kullanılan özel opsin bağlı olarak değişebilir. Bu protokolde, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP kullanılır ve stimülasyon paradigma / 40 sn kapalı 20 sn. SSFO AC için ışığın sadece kısa bir darbe gereklidir çünkü SSFO kullanılıyorsa, stimülasyon paradigma değişirgenelinde ekili ve daha sonra başka bir dalga boyunda ışık kısa bir darbe sona edilmesi.
ofMRI hayvan anestezi bile, görsel uyarı kaynaklanan bir karıştırıcı beyin sinyali engellemek için optogenetic uyarılması sırasında fiber optik patch kablo ile yüksük implant arayüzü ışık sızıntısını engelleyen performans ek kritik endişe. siyah elektrik bandı Kozalaklar yüksükler gelen ışığı engellemek için hayvanın gözlerini kapsayacak şekilde kullanılabilir. Önemli olarak, konunun ekspiratuar CO2 ve vücut sıcaklığı dahil olmak üzere, fizyolojik değerleri düzgün görüntüleme süresince muhafaza edilmelidir. 37 ° C 'de% 4 ve vücut sıcaklığı – ekspiratuar CO2 3 arasında tutulmalıdır. Buna ek olarak, shimming dizileri önce ofMRI büyük tarar elde KALIN verilerin kalitesini belirleyen başlangıç için manyetik alan içinde mümkün olduğu kadar homojen olmayan azaltır. Bu faktörlerin kontrolügüvenilir ofMRI veri üretiminde kritiktir. Bu protokol, DPSS lazerler Optogenetic uyarılması için ışık kaynağı olarak kullanılır. Lazer ışığı, tutarlı olduğu için, daha da fazla güç kolayca fiber optik ile temin edilebilir. Fiber optik bağlanmış LED ışık kaynakları ticari satıcılardan temin edilebilir, ancak ışık iletimi azalan güç dezavantajına sahiptir. lazer ışık kaynağı her bir fiber optik patch kablo uyum gerektirmez, ancak uygulama ile, hizalama dakika saniye içinde yapılabilir.
ofMRI gelecekteki uygulamaları gibi görüntüleme sırasında non-invazif uyarımı sağlamak için kırmızı-kaymıştır opsins gibi yeni nesil opsins kullanımını içerir. Ayrıca, MR-uyumlu EEG veya fiber optik implant ile birlikte benzer kayıt elektrotları implantasyonu MRG yüksek uzaysal çözünürlüğü verilere ek olarak, yüksek zamansal çözünürlüklü veri edinimi için izin verebilir. ofMRI ile Electrophvsiological kayıt beynin fonksiyonel bağlantı hakkında geniş bilgi verebilir. Özet olarak, genetik ya da anatomik kimliği tarafından tanımlanmış belirli bir hücre popülasyonlarının uyarılmaya karşılık olarak, tüm beyin izlemek için ofMRI gücü ofMRI nörolojik hastalıklar çalışmada sağlıklı beyin connectomics kullanımı kritik bir araçtır.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |