This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
Optogenetic ressonância magnética (ofMRI) é um nova técnica que combina a resolução espacial de alta-campo IRMf com a precisão de estimulação optogenetic 1-11,38, permitindo mapeamento de tipo específico de células de circuitos neuronais funcionais e suas dinâmica em todo o território cérebro. Optogenetics permite a tipos específicos de células a ser orientada para a estimulação pela introdução de canais de condutância trans-membrana, chamada opsinas sensíveis à luz. Elementos específicos de circuitos neurais são geneticamente modificadas para expressar esses canais, permitindo a modulação milissegundo-calendário de atividade no cérebro intacto 1-15. fMRI fornece um método não-invasivo de determinação da resposta dinâmica mundial do cérebro à estimulação optogenética dos circuitos neurais específicos através da medição do sinal de sangue oxigênio-dependente de nível (BOLD) 16-18, que fornece uma medida indireta da atividade neuronal.
A combinação destas duas técnicas, denominado optogenetic ressonância magnética (ofMRI), é vantajosa em relação a outros métodos de gravação durante a actividade cerebral, tais como a estimulação electrofisiologia, pois pode proporcionar uma vista de todo o cérebro em relativamente elevada resolução espacial. Isto permite a detecção da actividade neuronal em resposta a estimulação dirigida a grandes distâncias do local da estimulação, sem a necessidade para implantação de eléctrodos de registo invasivos 1-11. ofMRI é vantajoso sobre o método mais tradicional de realizar a estimulação elétrica durante fMRI, que pode recrutar diferentes tipos de células perto do eléctrodo e, portanto, confundir a influência causal de cada população 19. Além disso, os eléctrodos utilizados para a estimulação eléctrica e da corrente gerada podem produzir artefactos durante a RM 20. Com efeito, ofMRI permite a observação da influência sobre a actividade cerebral global a partir do modulati específicana de uma ampla variedade de tipos de células, através da utilização de técnicas avançadas de segmentação genética, tais como o sistema Cre-Lox em animais transgénicos ou a utilização de promotores. controlo óptico combinatória com monitorização de todo o cérebro é possível com ofMRI através da utilização de ambos NpHR para inibir e ChR2 para excitar tipos de células específicos. O kit de ferramentas optogenetic disponíveis para uso em ofMRI também está melhorando rapidamente ao longo do tempo com a introdução de opsins com o aumento da sensibilidade à luz ou cinética melhoradas, de opsins função etapa estabilizadas (SSFOs) ou de opsins vermelho-deslocado que pode anular a exigência de fibra implantado ópticas, permitindo a estimulação não-invasiva durante o exame 21. Estas possibilidades não estão disponíveis com estimulação elétrica.
No entanto, os artefactos sinal resultante de um aquecimento do tecido devido a um fornecimento de luz no cérebro têm sido relatados 22, onde foi mostrado modificação induzida pela temperatura de tempos de relaxação para produzir pseufazer a ativação. Pesquisadores do espectáculo ofMRI deve, portanto, estar ciente desta confundem potencial. Com a configuração e controlo adequado, a questão pode ser abordada. Além disso, relativamente baixa resolução temporal de medir a resposta hemodinâmica em fMRI pode ser um fator limitante para certas aplicações desta técnica.
Este protocolo descreve em primeiro lugar a construção dos implantes de fibra óptica que permitem uma entrega de comprimentos de onda específicos da luz profundamente no cérebro in vivo. O protocolo em seguida, descreve a entrega do vector viral que codifica para uma região opsina precisa cérebro utilizando cirurgia estereotáxica. Em seguida, o protocolo descreve o processo de ressonância magnética funcional do cérebro inteiro durante a estimulação de luz simultânea. Finalmente, o protocolo descreve a análise dos dados adquiridos dados de base.
De nota, a optogenética descrito aqui requerem um implante crônica para a entrega de luz. No entanto, os implantes de fibra óptica são estáveis e bio-compatível, permitindo varrimento longitudinal e investigação de circuito neural ao longo de um período de meses 23,24.
Em resumo, a estimulação precisa e capacidade de monitorização de todo o cérebro de ofMRI são factores cruciais para tornar ofMRI uma ferramenta poderosa para o estudo dos conectonomia do cérebro. Além disso, pode proporcionar um novo discernimento sobre os mecanismos das doenças neurológicas 25 quando acoplado com diferentes modelos animais. Com efeito, ofMRI foi usado para elucidar a actividade de sub-regiões do hipocampo de rede distintas associadas a convulsões 8. Portanto, laboratórios interessados em responder a perguntas de neurociência de nível de sistemas vai encontrar esta técnica de importância.
Movimento do assunto durante a imagem é uma fonte significativa de artefato que pode levar à corrupção de dados. Apropriadamente garantir o animal no suporte de imagem pode minimizar tais artefactos como irá manter níveis adequados de anestesia. Aqui, utilizou-se isoflurano mas anestésicos alternativos, tais como medetomidina ou cetamina e xilazina, deve também ser considerado. No entanto, os níveis e escolha do anestésico pode influenciar muitos parâmetros no cérebro, incluindo a resposta BOLD 28. Isoflurano pode causar alterações na excitabilidade neuronal 29. Outros anestésicos também pode afetar GABA inibição sináptica 30. Assim, a escolha da anestesia é importante quando se realiza ofMRI dada a sua capacidade de afetar a atividade neuronal. ofMRI na ausência de anestesia é possível, mas pode ser um desafio com o aumento do movimento do animal, o que pode ser reduzido se o animal está habituado; tais estudos ofMRI acordado previamente realizada umand evitaria o efeito de confusão da anestesia no cérebro 9,10. De pós-processamento de algoritmos de correcção de movimento pode ser usado para atenuar grandemente os efeitos de movimento. Vários desses métodos existem, incluindo o inverso algoritmo de Gauss-Newton empregada neste protocolo, o que minimiza a soma dos quadrados função custo da imagem de referência e imagem sob a correção. O algoritmo é útil porque permite a correção de movimento rápido e robusto, usando um design da plataforma paralela GPU para reduzir os tempos de processamento 27.
Para a reconstrução dos dados neste protocolo, software personalizado escrito em um ambiente MATLAB foi utilizado para reconstrução gridding bidimensional, onde as amostras em espiral são reconstruídos em k-espaço em imagens em grade 31-33. dados de séries de tempo foram gerados através do cálculo da modulação por cento do sinal NEGRITO de cada voxel em relação ao período da linha de base recolhido antes da estimulação. Voxels cuja séries temporais foram synchronized aos blocos de estimulação optogenética com um valor de coerência de 0,35 ou superior foram definidos como voxels activados; este valor coerência corresponde a um menor que 10 -9 valor P 8. Valores de coerência foram calculados como a magnitude da transformada de Fourier com a frequência dos ciclos de estimulação repetida dividido pela soma dos quadrados de-de todos os componentes de frequcia de 8,27. erro Familywise pode ser controlada usando a correção de Bonferroni para comparações múltiplas. métodos alternativos de análise pode ser utilizado, incluindo testes estatísticos paramétricos, tais como os modelos lineares gerais (MLG). O método requer o conhecimento de coerência menos antes da HRF em comparação com o modelo linear geral convencional. Portanto, é vantajoso quando está a explorar os dados usando ofMRI. No entanto, o método de coerência só pode ser usado para dados com desenhos ou bloco seleccionado modelos de eventos relacionados com um intervalo fixo interstimulus e não pode ser utilizado nos dados ofMRI com outro evento-RELAted desenhos ou modelos mistos. Subsequentemente, modelagem causal dinâmica (DCM) pode ser utilizada para analisar interacções entre regiões cerebrais identificados através ofMRI. DCM é uma técnica estatística Bayesian desenvolvido para análise da conectividade funcional de respostas do sistema para entradas experimentais durante fMRI 34.
preocupações técnicas adicionais para ofMRI são discutidos aqui. Os implantes podem ser danificados ou cair, levando à remoção do animal afectado do estudo. cirurgias de re-implantação não são recomendados devido à incerteza adicional de segmentação o mesmo ROI como na cirurgia de implante original e devido a questões de bem-estar animal. Por causa da quantidade significativa de tempo e recursos investir em cada sujeito animal, a apreciação da resistência do material é uma preocupação significativa na escolha de um cimento dentário adequado para utilização em estudos ofMRI. A cirurgia de implantação é um fator crítico para maximizar a longevidade do IMPLANt e sujeito animal. Por exemplo, assegurando que o crânio é seca antes de se aplicar o cimento dental e colocando uma quantidade adequada de cimento em torno do implante virola cerâmica pode garantir a estabilidade ao longo da linha do tempo potencial do animal meses de duração, durante o estudo. Além disso, modelos alternativos de gaiola pode ser explorado e discutido com a facilidade de cuidado animal local para evitar gaiolas com tops de arame, segurando a comida e água, que muitas vezes se projetam para dentro da jaula e oferecer oportunidades para que o animal danificar o implante. Importantemente, o cimento dental deve ser escolhido cuidadosamente para reduzir os artefactos que afectam imagiologia e cimentos alternativos pode ser testada por aplicação sobre um fantasma e imagens em um scanner antes do uso em experimentos com animais. Tentativa e erro com vários cimentos dentários mostrou que o cimento utilizado neste protocolo dá relativamente poucos artefactos. Outro desafio técnico na realização ofMRI é a precisão da colocação de fibra óptica no ROI pretendido, dada a extremely pequenas distâncias que podem existir entre os núcleos no cérebro 35. Depois de concluir as cirurgias de implantação, scans anatômicas ponderadas em T2 pode ser usada para determinar a colocação correta sobrepondo em um atlas do cérebro. A habilidade do cirurgião e da prática realizar estas cirurgias pode melhorar as taxas de colocação corretos. A especificidade e expressão da opsina na ROI pretendido pode ser verificado na conclusão do estudo de perfusão do animal e que fixa o cérebro, usando imuno-histoquímica ou a fluorescência endógena de um repórter em proteínas marcado para a opsina para visualização. Estas proteínas repórter pode ser também co-localizada com outras proteínas para assegurar que o opsina é expresso nos tipos de células neurais 1,8,15,25 desejados. Como mencionado anteriormente, os artefactos podem surgir quando se realiza ofMRI devido ao aquecimento do tecido a partir da entrega de luz 22. O aquecimento dos tecidos provoca a modificação de tempos de relaxação, resultando em sinal BOLD falsa. Para assegurar que a corrente alternadavação resultante da estimulação luz durante ofMRI não é devido a este artefacto, controlos opsina-negativa deve ser realizada em solução salina que injectada animais ou animais injectados com vectores de controlo fluoróforo (tal como o AAV-CaMKIIa-EYFP) sofrem ofMRI. Além disso, apenas fibras bem construídos implantes com uma boa eficiência óptica de transmissão de luz deve ser usado para remover a necessidade de utilização de altas potências de laser. estudos ofMRI foram realizados em que a falsa activação devido ao aquecimento dos tecidos não foi um problema 1,6-8,10,11.
No que respeita à escolha do vector para introduzir os genes necessários optogenetic em neurónios para a expressão, os AAV não são conhecidos por provocar doenças nos seres humanos e são, por conseguinte, uma opção conveniente, tendo em conta o nível de segurança biológica inferior necessário para usar estes agentes (BSL-1). Além disso, um grande número de núcleos vetor realizar AAV embalados com vários genes optogenética em estoque e com vários sorotipos. O serotipo de AAV deve ser escolhido based no alvo população de células destinadas a assegurar os níveis de expressão óptimos 36,37. Os lentivírus podem também ser usados, mas requerem um maior nível de segurança biológica. O período de tempo necessário para a expressão dos genes suficientes optogenetic é variável, dependendo do modelo animal específico utilizado, no AAV particular utilizada e no paradigma experimental específica. Neste protocolo, ratos Sprague Dawley às 11 semanas de idade são usados e estudos optogenetic começar quatro a seis semanas após a injecção do vírus. Os ratinhos transgénicos podem também ser utilizados em estudos optogenetic. É necessária a realização de experiências-piloto para determinar a quantidade específica de tempo necessário para a expressão suficiente dos opsins. paradigmas estimulação pode variar dependendo da opsina específico utilizado. Neste protocolo, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP é usado eo paradigma de estimulação é 20 seg on / off 40 seg. Se usando um SSFO, o paradigma da estimulação irá variar porque o SSFO requer apenas um breve pulso de luz seja ACvado e depois de um breve pulso de luz em outro comprimento de onda a ser finalizado.
Uma preocupação crítica adicional ao executar ofMRI está a impedir o vazamento de luz a partir da interface implante ponteira com o cabo de fibra óptica durante a estimulação optogenética para evitar um sinal cerebral de confusão proveniente de estimulação visual, mesmo quando o animal é anestesiado. Cones de fita isolante preta pode ser utilizada para bloquear a luz a partir das virolas e para cobrir os olhos do animal. Importante, valores fisiológicos, incluindo expiratório CO 2 e temperatura corporal do sujeito deve ser adequadamente mantida durante toda a duração da imagiologia. CO Expiratório 2 deve ser mantido entre 3-4% e a temperatura do corpo a 37 ° C. Além disso, as sequências shimming a reduzir tanto quanto possível falta de homogeneidade do campo magnético antes de se iniciar ofMRI verifica determina em grande parte a qualidade dos dados em negrito resultantes. O controlo destes factoresé crítico na produção de dados ofMRI fiáveis. Neste protocolo, DPSS lasers são usados como fonte de luz para a estimulação optogenética. Porque a luz laser é coerente, mais energia suficiente pode ser facilmente fornecido através da fibra óptica. fontes de luz LED acoplado a fibra óptica estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais, mas têm a desvantagem de poder diminuído de transmissão de luz. A fonte de luz laser exige alinhamento para cada cabo especial de correção de fibra óptica, mas com a prática, o alinhamento pode ser realizado dentro de segundos a minutos.
As aplicações futuras de ofMRI incluem o uso de opsins de próxima geração, tais como opsins vermelho-deslocou-se para permitir a estimulação não-invasiva durante o exame. Além disso, o implante de ressonância magnética compatível com EEG ou eléctrodos de registo semelhantes, juntamente com o implante de fibra óptica poderia permitir a aquisição de dados de alta resolução temporal, para além dos dados de alta resolução espacial de ressonância magnética. ofMRI com Electrophysiolgravação ogical poderia fornecer ampla informação sobre a conectividade funcional do cérebro. Em resumo, o poder de ofMRI para acompanhar todo o cérebro em resposta à estimulação de populações de células específicas definidas pela identidade genética ou anatómica faz ofMRI uma ferramenta essencial para utilizar no estudo de doenças neurológicas e dos conectonomia do cérebro saudável.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |