Facile e preciso meccano-profiling su micropost Array

Summary

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Abstract

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts.

The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow “mechano-profiling” of cell phenotypes.

A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Introduction

Saggi cellulari meccano-sensibili permettono di indagare cellule aderenti, con una vasta gamma di applicazioni che riflettono il ruolo centrale che la meccanica possono giocare in biologia cellulare. Queste applicazioni spesso si concentrano sui meccanismi di base che guidano i processi subcellulare o comportamenti a cellule intere. Da un lato, i fattori ambientali esterni come composizione della matrice extracellulare o rigidità matrice possono influenzare notevolmente la risposta meccanica e biologica di una cella. ¹ Lo stesso può essere osservato dopo l'uso di numerose classi di composti farmaceuticamente attivi, i cui effetti sono spesso caratterizzate usando modelli di coltura cellulare. ² D'altro canto proprietà genotipici, come quelle causate da mutazioni genetiche spontanee o indotta sperimentalmente, può indurre forti variazioni fenotipo cellulare che sono associati ad alterazioni nella struttura e funzione del citoscheletro. ³ Questi esempi sono solo alcune delle molte possibiliArgomenti per i quali fenotipizzazione meccanica delle cellule è rilevante, e tutti questi sono stati utilmente studiati con gli array micropost.

Al momento in cui scriviamo, circa 200 articoli sono stati pubblicati descrivono l'interazione cellule-micropost. Queste opere discutono aspetti teorici della micropost principi di deflessione e le istruzioni pratiche su loro fabbricazione. Il primo articolo descrive l'interazione delle cellule e array micropost flessibili è stata pubblicata da Tan e colleghi nel 2003. ⁴ In contrasto classica microscopia a forza di trazione (TFM) dove substrati molli continui sono utilizzati per stimare contrattilità cellulare nanonewton scala, Tan et al. descritto un metodo che utilizza multipli travi verticali strettamente distanziati di elastomero siliconico. I principali vantaggi di questa tecnica emergono due caratteristiche principali. Prima, per cambiare il substrato rigidità cellulare apparente basti cambiare le dimensioni micropost mantenendola composizione del substrato altrimenti costante ed evitando differenze di topologia superficiale e chimica. Seconda microposts agiscono come singole sorgenti che possono essere analizzati in modo discreto con forza e risoluzioni spaziali dell'ordine di singole adesioni focali e in grado di ridurre le sfide analitiche che sono inerenti all'analisi analoga dalla norma TFM.

Oggi la gamma di applicazioni per le matrici micropost supera di gran lunga solo la mappatura delle forze per un paio di singole cellule. Ad esempio, Akiyama riporta l'uso di un isolato tessuto vaso dorsale da un bruco falena come attuatore per una matrice micropost, al fine di sviluppare un insetto propulsione muscolare autonoma micro-robot. ⁵

Tuttavia, le applicazioni più pubblicati di microposts sono concentrati su studi di condizioni mediche come infezioni o cancro. Ad esempio, gli array micropost sono stati utilizzati per studiare la costituzione della forza di tipo IV in bundle pili di Neisseria gonorrhcolonie OEA che è associato con cascate di segnale migliorando infezione. ⁶ Altri hanno utilizzato microposts studiare le cellule del cancro al seno trattate con composti farmaceutici rivolte al citoscheletro. ⁷

Flessione di un micropost viene spesso descritto con la teoria classica del fascio per un cantilever con un carico fine assumendo la cellula si attacca solo alla punta estrema della micropost. Qui la forza applicata F che causa una deviazione δ dipende k "rigidezza flessionale" del micropost ed è calcolato mediante:

(1)

con E, I e L essendo il modulo di Young, superficie momento di inerzia e fascio lunghezza rispettivamente. Tuttavia, i risultati di questa equazione solo dare un'approssimazione generale delle forze in gioco dal fascio tranciatura e piegatura e deformazione substrato non vengono presi in accontare. Considerando che microposts sono in genere realizzati con materiali morbidi come il polidimetilsilossano (PDMS) a base di gomma siliconica di questi fattori devono essere inclusi. . Schoen et al hanno dimostrato che vi è un tale fattore di correzione in base al rapporto di aspetto del micropost (L / D) e il rapporto di Poisson del polimero corrispondente v ⁸ Si è dato da.:

(2)

Con T _inclinazione (v) essendo un coefficiente di inclinazione che include il parametro un raccordo = 1,3 come si possono trovare nello stesso articolo:

(3)

Ciò significa rigidità corretto del micropost k _corr è il prodotto del puro curvatura rigidezza k = k _bend e il fattore di correzione corrin:

(4)

Pertanto, i calcoli di forza delle cellule devono essere effettuate utilizzando la variazione più raffinata dell'equazione (1) ora di lettura:

(5)

L'impatto della correzione diventa più evidente non appena vengono utilizzati i valori tipici per le quote micropost. Ad esempio, una lunga micropost 15 micron con una sezione trasversale circolare e un diametro di 5 micron in gomma siliconica a base di PDMS porta ad un fattore di correzione di 0,77 e quindi un calcolo non corretta potrebbe sovrastimare le forze esercitate cellulari del 23%. Questo diventa ancora più grave per microposts con proporzioni minori.

Tradizionalmente, micropost analisi delle immagini si è basato anche sulla teoria flessione fascio idealizzato. Nel 2005 il gruppo che aperto la strada all'uso di MICRarray opost pubblicato un software di analisi delle immagini adatto per l'analisi micropost ⁹ Il software richiede una licenza software e l'utente deve prendere tre immagini per ogni posizione.; uno ciascuno da piani superiore e inferiore del micropost in trasmissione e un altro in modalità fluorescenza con la cellula colorata. Dopo aver confrontato le posizioni superiore e inferiore per ogni micropost il software determina un campo di forza vettoriale e calcola i parametri correlati come forza per posta. Esistono altri pacchetti software e loro principi di analisi sono brevemente menzionati negli articoli corrispondenti che li descrivono, ma questi pacchetti software di analisi non sono generalmente disponibili al pubblico. ^10,11

Gli array micropost progettati per forze cellulari mappatura possono essere classificati come essendo in un layout micropost ortogonali o uno esagonale, l'ultima delle quali hanno il vantaggio di lacune equidistanti tra tutti microposts vicini. Microposts tipici ettarive una sezione trasversale circolare e le loro dimensioni variano da 1,0 micron a 10 micron di diametro e 2 a 50 micron di lunghezza. ⁴ Tuttavia, sono stati riportati anche microposts a sezione ellittica o quadrata. ^12,13

L'uso di miscele a base di silicone-PDMS come materiale micropost permette di aggiungere nanoparticelle nella miscela. Per esempio l'aggiunta di cobalto nano-barre consente un'attivazione magnetico della micropost e quindi dà un grado di libertà per i potenziali progetti sperimentali. ¹⁴ maggior parte dei gruppi producono i loro allineamenti micropost su substrati rigidi piatti come copertura in vetro o all'interno di una capsula di Petri. Tuttavia, Mann e collaboratori recentemente riportato una matrice micropost formata su una membrana elastica. ¹⁵ Ciò consente l'applicazione di cellule che si estende forze di cellule aderenti durante gli studi live-cell subcellulare risposte dinamiche in termini di contrattilità delle cellule.

L'e più isti largamente impiegatoprocesso tuito per rendere gli array micropost è basato su litografia soft, come descritto nei protocolli penetranti di Sniadecki e colleghi. ^16-18 Nei processi standard, camere bianche brevi sono usati per generare le microstrutture sulla cima di un wafer di silicio con photoresist SU8. Questa è seguita da un processo di copia in cui la gomma di silicone è gettato sulle strutture che li trasferiscono in stampi. In una seconda fase questi stampi sono utilizzati per replicare la microstruttura iniziale utilizzando gomma siliconica su di un substrato scelto. Tuttavia, nonostante il grande e crescente numero di pubblicazioni relative alla loro applicazione, stabilendo un processo di fabbricazione per microposts richiede una notevole quantità di tempo anche per gli esperti di micro-ingegneria; ci sono molte fasi di processo che richiedono ottimizzazione e adattamento all'ambiente specifico laboratorio e la layout micropost per produrre un livello di qualità accettabile.

Array micropost commerciali sono ora disponibili in un ready-tformato o-uso ("off-the-shelf") con una qualità elevata e costante. Come tali sono un'alternativa al lungo e complesso processo di produzione necessarie per la produzione in loco. In questo lavoro un allineamento micropost disponibile in commercio è stato utilizzato per la mappatura delle forze cellulari utilizzando una singola immagine al microscopio un campo chiaro. Ancora più importante questo articolo descrive e documenta un software open-source pienamente funzionale denominato MechProfiler, che è disponibile per il download come materiale supplementare di questo manoscritto. Una versione attivamente mantenuto del software si possono trovare anche in http://www.orthobiomech.ethz.ch.

La combinazione di un saggio "off-the-shelf" e una compatibile con software di analisi open source riduce notevolmente l'ostacolo ingresso per raggiungere esperimenti TFM accurate. I ricercatori non hanno accesso a entrambi i servizi in camera puliti o esperienza di sviluppo di software in grado di analizzare le forze cellulari con successo. Esso consente all'utente di concentrarsi sulle mechanosensitivity uscita test piuttosto che la tecnologia stessa, e fa misure di forza di trazione disponibili a una comunità più ampia. Inoltre, questo è un passo importante per spianare la strada verso lo screening completamente automatica di array micropost.

Il software di analisi MechProfiler elabora le immagini in file di formato tiff, png, bmp e jpg. Le immagini possono essere scattate con la fluorescenza, contrasto di fase o in campo chiaro microscopia ottica. Il programma standalone funziona insieme con la libera Matlab compilatore runtime (disponibile presso: Figura 12) e gli algoritmi sottostanti consentire l'elaborazione delle immagini semplificata, che permette all'utente di elaborare immagini con cellule singole o multiple in circa 1 min. Inoltre, queste cellule possono essere o vivere o "fissi".

Il software MechProfiler è in grado di aumentare notevolmente la velocità di analisi dei dati basandosi su riproducibilità di array micropost qualità commerciale, più specificamente, il default e #8220, non deviato "posizione di ogni post nella matrice si può presumere contro una griglia ideale (tolleranze di fabbricazione per la griglia in matrici utilizzate per questo studio sono stati inferiori a 100 nm).

In breve si apre una selezione di file di immagine per l'analisi, le colture per la regione di interesse, definisce i posti coperti dalle cellule o che devono essere scartati, determina le posizioni postali, calcola le deformazioni / forze contro la griglia ideale, e, infine, salva tutti i dati specifici delle cellule con la possibilità per l'esportazione, tra cui a un ufficio foglio elettronico standard.

Protocol

1. coltura di cellule su micropost Array Nota: Tutte le operazioni devono essere eseguite in un armadio biosicurezza per garantire la sterilità. I volumi qui indicate sono per T25 fiasche di coltura cellulare. La coltura cellulare medio ricetta e la semina delle cellule densità sono ottimizzati per le linee di cellule di cancro osseo HuO9 e M132. Preparare una coltura cellulare per la semina su una matrice micropost. Controllare la qualità coltura cellulare posizionand…

Representative Results

Il vantaggio principale della tecnica descritto risiede nella sua semplicità e potenziale di integrazione rapida ed efficace nel lavoro di laboratorio di routine. La combinazione di array di sensori commerciali di alta qualità abbinati a software open source fornisce informazioni sulla sensibilità meccano che altrimenti richiede l'accesso ai servizi camera bianca e una conoscenza approfondita di analisi di immagine e di sviluppo del software. La Figura 1 illustra il flusso di lav…

Discussion

Questo lavoro si propone di avanzare il campo della microscopia a forza di trazione da una consistente riduzione delle barriere tecniche e pratiche all'ingresso. Queste barriere provengono da due lati. In primo luogo sono le numerose sfide tecniche non banali che devono essere superati per la produzione riproducibile e commissionare una matrice micropost sperimentalmente. In secondo luogo, è similmente non banale necessità di una affidabile analisi semiautomatico delle forze monocellulari – tenendo presente che un…

Materials

T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions:
pre-coated with Collagen I/Fibronectin			Ø= 6.4 µm, l=18.2 µm; grid= 13 µm, kcorr= 2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera