Facile e preciso meccano-profiling su micropost Array

Summary

Descritti sono i protocolli per quantificare le interazioni meccaniche tra cellule aderenti e substrati microstrutturati. Queste interazioni sono strettamente legate a comportamenti cellulari essenziali tra cui la migrazione, la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi. I protocolli presentano un software di analisi delle immagini open source chiamato MechProfiler, che consente di determinare le forze coinvolte per ogni micropalo.

Abstract

I substrati di coltura cellulare con micropost flessibili integrati consentono all'utente di studiare le interazioni meccaniche tra le cellule e l'ambiente circostante. In particolare, le interazioni cellula-substrato sono l'interesse principale. Oggi, gli array di micropost sono un metodo ben caratterizzato e consolidato, con un'ampia gamma di applicazioni che sono state pubblicate nell'ultimo decennio. Tuttavia, sembra esserci una riserva tra i biologi nell'adattare la tecnica a causa del lungo e impegnativo processo di produzione dei micropost insieme alla mancanza di un software facilmente accessibile per l'analisi delle immagini delle cellule che interagiscono con i micropost.

La lettura della forza dai micropost è sorprendentemente facile. Un microperno agisce come una molla con la cella idealmente attaccata alla sua punta. A seconda delle dimensioni, una cellula applica la forza dal suo citoscheletro attraverso uno o più punti di adesione focale al microperlo, deviando così il micropalo. La quantità di deflessione è direttamente correlata alla forza applicata in direzione e in grandezza. Il numero di micropost coperti da una cellula e i modelli di deflessione dei post sono caratteristici e consentono la determinazione di valori come la forza per perno e molti parametri biologicamente rilevanti che consentono la "profilazione meccanica" dei fenotipi cellulari.

Un metodo conveniente per la profilazione meccanica è descritto qui combinando la prima generazione di micropost pronti all'uso disponibili in commercio con un pacchetto software sviluppato internamente che è ora accessibile a tutti i ricercatori. Come dimostrazione dell'applicazione tipica, sono state scattate singole immagini di cellule tumorali ossee in microscopia a campo chiaro per la meccanoprofilazione di modelli di metastasi di linee cellulari. Questa combinazione di sensori di forza di trazione commerciali e software open source per l'analisi consente per la prima volta una rapida implementazione della tecnica del micropost array nel lavoro di laboratorio di routine svolto da utenti non esperti. Inoltre, un processo di analisi robusto e semplificato consente all'utente di analizzare un gran numero di immagini micropost in modo altamente efficiente in termini di tempo.

Introduction

Saggi cellulari meccano-sensibili permettono di indagare cellule aderenti, con una vasta gamma di applicazioni che riflettono il ruolo centrale che la meccanica possono giocare in biologia cellulare. Queste applicazioni spesso si concentrano sui meccanismi di base che guidano i processi subcellulare o comportamenti a cellule intere. Da un lato, i fattori ambientali esterni come composizione della matrice extracellulare o rigidità matrice possono influenzare notevolmente la risposta meccanica e biologica di una cella. ¹ Lo stesso può essere osservato dopo l'uso di numerose classi di composti farmaceuticamente attivi, i cui effetti sono spesso caratterizzate....

Protocol

1. coltura di cellule su micropost Array

Nota: Tutte le operazioni devono essere eseguite in un armadio biosicurezza per garantire la sterilità. I volumi qui indicate sono per T25 fiasche di coltura cellulare. La coltura cellulare medio ricetta e la semina delle cellule densità sono ottimizzati per le linee di cellule di cancro osseo HuO9 e M132.

1. Preparare una coltura cellulare per la semina su una matrice micropost.
   1. Controllare la qualità coltura cellulare posizionando il pallone di coltura su un microscopio ottico standard. Assicurarsi che le cellule mostrano una crescita e morfologia tipica stimando quanto del fondo....

Results

Il vantaggio principale della tecnica descritto risiede nella sua semplicità e potenziale di integrazione rapida ed efficace nel lavoro di laboratorio di routine. La combinazione di array di sensori commerciali di alta qualità abbinati a software open source fornisce informazioni sulla sensibilità meccano che altrimenti richiede l'accesso ai servizi camera bianca e una conoscenza approfondita di analisi di immagine e di sviluppo del software. La Figura 1 illustra il flusso di lavoro del.......

Discussion

Questo lavoro si propone di avanzare il campo della microscopia a forza di trazione da una consistente riduzione delle barriere tecniche e pratiche all'ingresso. Queste barriere provengono da due lati. In primo luogo sono le numerose sfide tecniche non banali che devono essere superati per la produzione riproducibile e commissionare una matrice micropost sperimentalmente. In secondo luogo, è similmente non banale necessità di una affidabile analisi semiautomatico delle forze monocellulari - tenendo presente che un t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Palloni per colture cellulari T25	Nunc	156367
1x tampone PBS	Sigma	D8537
0,5% Tripsina-EDTA	Life Technologies	15400054
Medio DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillina-Streptomicina 100x	Sigma	P4333
Fiale da centrifuga da 15 ml	Sarstedt	62.554.502
Micropost array pre-rivestito con Collagene I/Fibronectina	MicroDuits	MPA-col1/FN	Dimensioni Micropost: Ø=6.4  µ m, l=18,2 µ m; griglia=13 µ m, kcorr=2.87  nN/µ m
Etanolo abs p.A.	Merck	100.983
Piastra a 12 pozzetti	Nunc	150628
Soluzione di formalina, tampone neutro 10%	Sigma	HT5011
Blu brillante G-250	Sigma	27815	Blu di Coomassie
Metanolo ACS p.A.	Merck	1.06009
Acido acetico	Sigma	695092
Piatto inferiore in vetro	WillCo Wells BV	GWSb-3522	Diametro 35 mm, apertura 22  mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Microscopio invertito
D3-L3	Nikon	n/a	Controllo fotocamera
DS Fi2	Nikon		Camera