Meten Attachment en internalisering van influenza A-virus in A549 cellen door flowcytometrie
Summary
We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.
Abstract
Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 °C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.
Introduction
De vermelding van influenza A virus (IAV) is een meerstaps proces dat begint met de binding van het virus aan receptoren op het plasmamembraan van doelcellen 1. De receptor voor IAV is siaalzuur dat aanwezig is op een grote verscheidenheid aan glycoproteïnen en glycolipiden is. Het hemagglutinine (HA) -eiwit van IAV die in de virale omhulling bindt aan siaalzuur en daardoor medieert hechting van het virale deeltjes naar de plasmamembraan van doelwitcellen 2. Het virus komt in de cellen via clathrine-gemedieerde endocytose, maar ook alternatieve ingang trajecten, zoals macropinocytose, beschreven 06/03. De interactie tussen HA en siaalzuur lijkt voldoende te bemiddelen zowel bevestiging en triggering internalisatie van virale deeltjes 7 zijn. Toch hebben alternatieve ingang receptoren voorgesteld en hun rol in IAV binnenkomst worden momenteel onderzocht 1,8,9.
Curteel wordt gestreefd naar gastheerfactoren die betrokken zijn in de virale levenscyclus met als doel het ontwikkelen dringend nieuwe antivirale therapieën 10-12 identificeren. Virusingang zou een gunstige stap voor het richten IAV groei om virale infectie te blokkeren in zijn vroegste punt. Meten verschillende stadia van IAV binnenkomst experimenteel is uitdagend gewoonlijk grote hoeveelheden virus moeten binnenkomende virus op te sporen. Bovendien, het detectiebereik veranderingen in virusingang alleen lineair door het ontbreken van virale replicatie. Dit onderstreept de behoefte aan assays met hoge gevoeligheid.
De assay hier geïntroduceerde maakt detectie mogelijk van bijgevoegde virus op het celoppervlak en detectie van geïnternaliseerde virus in verhouding tot de totale hoeveelheid van cel-geassocieerd virus. Het gebruik van gebiotinyleerde wildtype virus maakt handig meting door middel van kleuring met STV-Cy3 en uitlezing door flowcytometrie. Gebiotinyleerde virus is koud-gebonden aan cels beslaglegging laten maar internalisatie van virale deeltjes te voorkomen. Cellen kunnen worden gefixeerd, permeabel en gekleurd met STV-Cy3 bijgevoegde virus te meten. Het signaal van extracellulaire, verbonden virions kunnen worden ingetrokken wanneer een blokkeringsstap wordt aangebracht voordat fixatie waarin de cellen worden geïncubeerd met niet-gemerkt streptavidine (STV). In een volgende stap, na binding van gebiotinyleerd IAV, temperatuur verschoven naar 37 ° C en internalisatie van virale deeltjes mag plaatsvinden. Geïnternaliseerde deeltjes worden beschermd tegen de binding van STV waardoor de discriminatie tussen extra- en intracellulaire virussen.
Per experimentele conditie, zijn vier monsters vereist: '0 min': Het eerste monster gelabeld "0 min", om koud virus gebonden aan het celoppervlak te meten. "0 min + STV De tweede monster gelabeld" 0 min + STV ", geeft de basislijn signaalintensiteit van het experiment. Bijgevoegde virus wordt geblokkeerd with STV en het signaal na kleuring met STV-Cy3 moet veel lager zijn in vergelijking met het "0 min" sample. '30 Min ': Het derde monster '30 min' bevat bevestigd en geïnternaliseerd virus vanwege de temperatuurverandering tot 37 ° C gedurende 30 min. '30 Min + STV ': De vierde monster, '30 min + STV' maatregelen de intracellulaire fractie van virussen. De STV blokkeringsstap wordt toegepast na de 30 min incubatieperiode. Hierdoor worden virale deeltjes aan het celoppervlak gebonden STV waarbij alleen geïnternaliseerd virussen vindt kleuring met STV-Cy3. De relatieve hoeveelheid virus geïnternaliseerd kan worden berekend als de verhouding van geïnternaliseerde virus (gemeten in de '30 min + STV "sample) gedeeld door de totale hoeveelheid virus (beschreven door '30 min 'sample).
Als controles raden we aan mock-geïnfecteerde cellen bevatten. Het signaal volgende STV-Cy3 kleuring van mock-geïnfecteerde cellen geeft de achtergrondals gevolg van de kleuringsprotocol. Hendel om IAV bevestiging is de voorbehandeling van cellen met bacteriële neuraminidase (NA). NA splitst siaalzuur van cellulaire glycoproteïnen, waardoor het verwijderen hechting receptoren van het celoppervlak. Natriumazide (SA) is een krachtige metabole remmer en blokkeert daarbij endocytose 13. Cellen behandeld met natriumazide moet positief voor virus bindend, maar negatief voor internalisatie zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ons protocol beschrijft een gemakkelijke manier van meten virusbinding en internalisatie onder toepassing van stroomcytometrie. Het maakt gebruik van gemerkte wildtype virus dat nabootst nauwer virusinfecties vergelijking met het gebruik van virus-achtige deeltjes (VLP). Terwijl onze protocol is geoptimaliseerd voor bevestiging en internalisering van IAV meten kan gemakkelijk worden aangepast voor andere virussen. Bovendien, als flowcytometrie wordt gebruikt voor het uitlezen, co-kleuringen eenvoudig worden toegevoegd a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Swiss National Science Foundation (31003A_135278) naar SSt. MOP is de begunstigde van een doctoraal subsidie van het Fonds AXA Research. Wij danken Patricia Nigg voor hulp bij het ontwerp van figuur 1.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
Riferimenti
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virolog. 2, (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G., Macey, M. G. . Flow Cytometry Principles and Applications. , (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
