כימות ברזולוציה גבוהה של התנהגות מודרכת ריח<em> תסיסנית melanogaster</em> שימוש ב<em> Flywalk</em> פרדיגמה
Summary
Flywalk מערכת מעקב האוטומטי משמש לכימות ברזולוציה גבוהה של מודרך ריח התנהגות בmelanogaster תסיסנית.
Abstract
בסביבתם הטבעית, חרקים כגון החומץ לטוס תסיסנית melanogaster מופגזים עם כמות עצומה של odorants כימי השונה. כדי לסבך את העניינים עוד יותר, הריחות זוהו על ידי מערכת העצבים החרקים הם בדרך כלל לא תרכובות בודדות אלא תערובות הרכב יחסי ריכוז ו משתנים. זה מוביל לסכום כמעט אינסופי של גירויי ריח שונים שצריכים להיות מוערכים על ידי מערכת העצבים.
כדי להבין שהיבטים של גירוי ריח לקבוע את הערכתה על ידי הזבוב, זה לכן רצוי לבחון מודרך ריח התנהגות כלפי ניחוחי רב ותערובות ריח ביעילות. ישירות לתאם התנהגות לפעילות עצבית, התנהגות צריכה לכמת במסגרת זמן דומה ובתנאים זהים לגירוי בניסויי neurophysiological. עם זאת, bioassays חוש הריח המשמש כיום רב בneuroethology תסיסנית למדי specialized גם כלפי יעילות או לרזולוציה.
Flywalk, מערכת מסירת הריח ומעקב אוטומטית, מגשרת על הפער בין היעילות ורזולוציה. היא מאפשרת הקביעה מתי בדיוק מנות ריח מגורה זבוב הולך בחופשיות, וכדי לקבוע את animal's תגובה התנהגותית דינמית.
Introduction
מטרת העל של כל מחקר neuroethological היא להקים קשר סיבתי בין מדינות הפעילות של תאי עצב בודדים או מעגלים עצביים וההתנהגות של האורגניזם. כדי להשיג מטרה זו פעילות עצבית והתנהגות צריכה להיות במעקב בתנאי גירוי זהים ותנאי גירוי אלה אידיאלי צריכים להיות דומים לאלה של מערכת העצבים תחת בדיקה התפתחה הגיוני של. במיוחד כאשר מדובר בהתנהגות bioassays, הדרישות אלה הוכיחו די תובעניות מבחינה היסטורית בדרוזופילה melanogaster neuroethology חוש הריח.
ברגע ששוחרר מהמקור, נוצות ריח במהירות להתפרק לדקים חוטים עם דיפוזיה הסוערת שנגרמה על ידי תנועת אוויר להיות הקובע העיקרי של הפצת ריח 1. כתוצאה מכך, חרקים ניווט לכיוון מקור ריח חווה גירוי לסירוגין עם חבילות ריח וביניהם מרווחים משתנה של אוויר נקי. שְׁנֵיהֶםהליכה וחרקים מעופפים – כולל תסיסנית – כבר הוכיח לנצל משטר גירוי לסירוגין זה לניווט על ידי גואה נגד הרוח על מפגש פלומה ובעיקר מרגש רוח צולבת בהעדר הריחות 2 – 5. ואילו נהלי גירוי בניסויים פיסיולוגיים לחקות במידה רבה אלה חרקים עלולים להיתקל בסביבתו הטבעית או על ידי עננים בודדים מתן של ריחות וביניהם תקופות ממושכות של אוויר נקי או רצפי גירוי דינמיים 6-11, רב bioassays התנהגות בשימוש בneuroethology תסיסנית כגון assay מלכודת , זירות שטח פתוח או T-מבוך להסתמך על ריח הדרגתיים 12 – 15. עם זאת, בגלל ריח הדרגתיים על ידי הגדרה משתנות בריכוז בהתאם למרחק ממקור הריח, התנהגות מסוימת לא ניתן לייחס לריכוז ריח מדויק באמצעות פרדיגמות אלה. בנוסף, שיפועשיפוע ריח ביקורתי תלוי במאפייני physicochemical של odorant. שיפוע של מתחם תנודתיות גבוהה יהיה רדוד יותר שנוצר על ידי תרכובת פחות תנודתי ולכן גם קשה יותר לעקוב אחר לאורגניזם להסתמך על מדידת הבדלי ריכוז בחלל כאמצעי היחיד של ניווט 16 – 20, דבר שעלול להוביל לפרשנות שגויה העדפות ריח במיוחד במבחני בחירה. השפעה זו היא גם מזיקה מאוד כאשר חוקר התנהגות כלפי תערובות ריח, כי זה מוביל ליחסי רכיב תערובת שונים בכל נקודה במרחב, ולכן שוב מונע מתאם ברור בין פיזיולוגיה והתנהגות.
בעוד זבובי חומץ נוטים לצבור על תסיסת פרי, הם בודדים בניווטם כלפי מקורות מזון ואתרי ההטלה. עם זאת, פרדיגמות התנהגות רבות ולא בודקים בעלי חיים בודדים המשמשות בneuroetholo תסיסניתGY לבחון את ההתנהגות מודרכת ריח של קבוצות של זבובים ומשיכה הוא הבקיע כחלק מזבובי בחירת הריח על גירוי שליטה. ניסויי עוקבה אלה תרמו רב להבנת neuroethology זבוב ורב של התצפיות שנעשו על ידי שימוש בהם יכול להיות מאושר בניסויים חד-זבוב. עם זאת, היא נצפתה שעפה יכולה להשפיע כל החלטת other's 21 ובמקרים קיצוניים ההערכה של ריח יכולה לעבור מאדישות להימנעות בהתאם לצפיפות אוכלוסיית 22. בנוסף, תוצאות מסוג כזה של ניסויים אלה לעתים קרובות לספק רק את נקודת הסיום של רצף של החלטות התנהגותיות ולא התבוננות מה הזבוב עושה בזמן שהוא עושה את זה, שיהיו רצוי בעת הניסיון לתאם התנהגות עם פעילות עצבית. ניסויי עוקבה ברזולוציה נמוכה ולא אלה בניגוד ידי שיטות יחידה לטוס ברזולוציה גבוהה כגון זירות קשורות טיסה והליכונים המאפשריםלתצפית ישירה של תגובות התנהגותיות בזמן הגירוי מוצג 20,23,24. עם זאת, ניסויי עוקבה עדיין פופולריים, כי הם יעילים מאוד ומספקים תוצאות חזקות גם בcomparably גודל מדגם נמוך בגלל שונות בין-אישיות ובין-משפט הן ממוצעים החוצה באופן חלקי בשל התצפית של אוכלוסיות על פני תקופות זמן ארוכות. בעוד טיסה והליכון קשורים כנראה לספק סטנדרטי הנוגעים להצגת גירוי והחלטה זמנית זהב, הזירות משמשות מיועדות לבעלי חיים יחידים ולכן מנת להשיג גודל מדגם דרוש לניתוח סטטיסטי זמן רב. לאחרונה כמה גישות אחרות פותחו המאפשרות רכישה יעילה של נתונים התנהגותיים ברזולוציה גבוהה בשילוב עם משטר גירוי מוגדר היטב. אלה כוללים 3D מעקב ללא השגחה של זבובי חומץ מרובים בwindtunnel בשילוב עם 3D מודל מדויק של פלומת ריח 5 </sup>, מעקב של זבובים בודדים מרובים בתאי בחירה מסופקים עם זרמי אוויר משני הצדדים 25 ואת הפרדיגמה Flywalk 26.
בFlywalk, 15 זבובים בודדים נמצאים בצינורות זכוכית קטנים ומנוטר באופן רציף על ידי מצלמה מעל תחת האורות אדומים תנאים. ריחות מתווספים קרון רציף של 20 סנטימטר / sec ולנסוע דרך צינורות הזכוכית במהירות קבועה. הקרון הוא humidified ידי העברתו דרך 250 בקבוקי מיליליטר המכילים מים מזוקקים (אדים) לפני הכניסה למערכת מסירת הריח. עמדות flies' נרשמות בתוך אזור כיכר של העניין (ROI) המקיף את רוב אורכו של צינורות הריח (אך לא כולל את הקצוות החיצוניים של הצינורות (כ 5 מ"מ בכל צד) שבו הזבובים אינם יכולים לנוע למעלה או נוסף בכיוון הרוח) בערך בזמן של מצגת ריח (איור 1 א ', ב'). זהויות לטוס נשמרות קבועות על ידי T מערכת המעקבhroughout הניסוי על בסיס Y-העמדות (כלומר שפופרת זכוכית הגבולות שלהם) שלהם. גירוי ריח מושגת באמצעות מכשיר גירוי רב-רכיב המאפשר ההצגה של עד 8 ריחות אחת וכל תערובות האפשריות 26,29 (איור 1). במהלך ניסוי מבוקר על ידי מחשב המסדיר את מערכת מסירת הריח ואיסוף טמפרטורה ולחות מידע (מחשב 1, איור 1 ג). מחשב זה שולט גם datalogger (להתחיל / הקלטה להפסיק) במחשב שני ברציפות שעוקב עמדות לטוס ב 20 מסגרות לשנייה (מחשב 2). טוס עמדות, מצב שסתום ריח (כלומר נקודת הזמן של פתיחת שסתום), מזהה ריח, טמפרטורה ולחות סביב מחזורי גירוי ריח מחוברים במחשב 2. בדרך זו מידע על ריח ולעוף עמדות מסונכרנות ומיוצאים כקובץ csv-קבצים ש יכול להיות מעובד יותר ונותח באמצעות ניתוח שגרה אישית בכתב. כיהמערכת כולה היא בשליטת מחשב, ללא התערבות אנושית יש צורך בהפעלה ניסיונית.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שמערכת Flywalk מופיעה ולא מתוחכמת במבט ראשון, להגדיר פעם אחת ולהפעלתו היא קלה לשימוש ומייצר תוצאות מאוד חזקות. להדגיש את העקביות של התוצאות הופקו במבדק זה ניתן לומר כי תוצאות הנציג המוצגות כאן התקבלו כמעט 2 שנים לאחר שהחלק מהתוצאות שמוצגים במחקר קודם 29 עם התק…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים דניאל פייט לקבלת סיוע טכני ופדרו Gouveia בElectricidade Em PO (electricidadeempo.net) להתאמה אישית של תוכנת המעקב לדרישות שלנו. אנו מודים גם טום Retzke לתמיכה בתהליך הצילומים. מחקר זה נתמך על ידי אגודת מקס פלאנק.
Materials
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
Riferimenti
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D. Pheromone-regulated anemotaxis in flying moths. Science. 184 (4140), 999-1001 (1974).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M. Osmotropotaxis in Drosophila melanogaster. J. Comp. Physiol. A. 147 (4), 479-484 (1982).
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (3), 708-712 (1974).
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
