Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

Summary

La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

Abstract

La couche externe de granules cérébelleux (EGL) est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement, et un excellent modèle pour l'étude de la prolifération et de la différenciation neuronale. En outre, les modifications évolutives de sa capacité proliférative ont été responsables de l'expansion spectaculaire de la taille du cervelet dans les amniotes, rendant le cervelet un excellent modèle pour les études évo-dévo du cerveau des vertébrés. Les cellules constitutives de l'EGL, progéniteurs granulaires du cervelet, représentent également une cellule d'origine significatif pour le médulloblastome, la tumeur pédiatrique neuronale la plus répandue. Après un transit amplification, précurseurs granules migrent radialement dans la couche granulaire interne du cervelet où ils représentent la plus grande population de neurones dans le cerveau des mammifères mature. En poussin, le pic d'EGL prolifération se produit vers la fin de la deuxième semaine de gestation. Afin de cibler la modification génétique de cette couche aule pic de la prolifération, nous avons développé une méthode de manipulation génétique par électroporation ex vivo de tranches de cervelet de jour embryonnaire 14 embryons de poulet. Ce procédé reprend plusieurs aspects importants de granule développement in vivo de neurones et sera utile pour générer une compréhension approfondie de la prolifération des cellules du cervelet de granulés et de la différenciation, et donc du développement de cervelet, l'évolution et la maladie.

Introduction

Le cervelet se trouve à l'extrémité antérieure du cerveau postérieur et est responsable de l'intégration du traitement sensoriel et moteur dans le cerveau mature ainsi que la régulation des processus cognitifs supérieurs ^1. Chez les mammifères et les oiseaux, il possède une morphologie complexe et est fortement feuilleté, un produit de grande amplification des progéniteurs de transit au cours du développement, qui produit plus de la moitié des neurones dans le cerveau adulte. Le cervelet a été un sujet d'étude pour les neurobiologistes pour des siècles et dans l'ère moléculaire a également reçu beaucoup d'attention. Cela concerne non seulement à sa biologie intrinsèquement intéressante, mais aussi au fait qu'il est fortement impliqué dans les maladies humaines, y compris les troubles génétiques de développement tels que les troubles du spectre autistique ^{2 et} plus en évidence le cancer du cervelet, médulloblastome ^{3, qui est} le cerveau pédiatrique la plus répandue tumeur. Surtout, il est un excellent système de modèle au sein de which pour étudier la répartition de sort et la neurogenèse au cours du développement du cerveau ^4. Au cours des dernières années, il a également été établi comme un système modèle pour l'étude comparative du développement du cerveau, en raison de la grande diversité des formes cérébelleux vu à travers la phylogénie des vertébrés ^5-10.

Le cervelet se développe à partir de la moitié dorsale de rhombomère 1 dans le cerveau postérieur et de développement ¹¹ est constitué de deux populations de cellules progénitrices primaires, la lèvre rhombique et la zone ventriculaire. La lèvre rhombique étend autour de la région dorsale de la neuroépithélium du cerveau postérieur à la frontière avec la plaque de toit. Il est le lieu de naissance des neurones excitateurs glutamatergiques du cervelet ^12-14. La zone ventriculaire donne lieu à des neurones inhibiteurs GABAergiques cérébelleux, le plus en évidence les grands neurones de Purkinje ^14,15. Plus tard dans le développement (d'environ jour embryonnaire 13,5 chez la souris; e6 en poussin ^16), glutamatergique Progenvisi- migrer tangentiellement à partir de la lèvre rhombique et forment une couche piale progéniteurs: une zone de progéniteur secondaire appelée la couche de granulés externe (EGL). Il est de cette couche qui subit l'amplification très étendue de transit qui conduit à le grand nombre de neurones granulaires présents dans le cerveau mature.

Prolifération dans le EGL a longtemps été associé à l'emplacement du sous-pial qui résulte de la migration tangentielle à partir de la lèvre rhombique ^17, avec le commutateur de sortie du cycle cellulaire et la différenciation neuronale de progéniteurs étant associée à leur sortie de la couche EGL extérieur dans le milieu EGL ^18. La migration tangentielle étendue de cellules granulaires post-mitotiques dans l'axe médio-latérale se produit dans la moyenne et interne EGL ^19, avant la migration radiale finale dans la couche intérieure de granules du cortex cérébelleux mature. Migration de cellules de la lèvre rhombique sur la surface du cervelet dépend signalisation CXCL12 de la ^pie-20-22 </sup> Cellules granulaires et expriment le récepteur CXCR4 CXCL12. Leur migration tangentielle est donc sans rappeler celui de la migration des populations tangentiellement néocortex des interneurones inhibiteurs ^23-25. Curieusement, études au microscope électronique ^{17 ont} suggéré que les cellules EGL avec une morphologie proliférative maintenir le contact pial, reliant le comportement des cellules avec une capacité de prolifération d'une manière qui rappelle les progéniteurs basales du cortex des mammifères ^26. Ceci se reflète dans la stratification précitée de la EGL en trois sous-couches qui sont définies par des environnements extracellulaires distinctes et où granulés précurseurs ont l'expression du gène ¹⁸ signatures distinctes.

Prolifération des progéniteurs dans la oEGL se produit avec une distribution normale des tailles de clones de sorte que lorsque les progéniteurs sont génétiquement marquées individuellement à la fin du développement embryonnaire chez la souris, ils donnent lieu à une moyenne médiane de 250 à 500 g postmitotiqueneurones ranule ^27,28. Prolifération dépend de signalisation SHH mitogénique sous-jacents neurones de Purkinje ^29-32. La capacité à répondre à SHH a été montré pour être entièrement dépendant de cellule autonome expression du facteur de transcription Atoh1, à la fois in vitro et in vivo ^{33 34,35.} De même, la sortie du cycle cellulaire et de la différenciation a été démontré que l'expression dépendant du facteur de transcription en aval NeuroD1 ^36, ce qui est probablement un répresseur directe de Atoh1 ^37.

Malgré ces progrès, et le progrès considérable à déchiffrer la base biologique de la cellule de sortie du cycle cellulaire ^38-42, le mécanisme moléculaire fondamentale (s) qui sous-tendent la décision de quitter le cycle cellulaire et la transition d'un ancêtre à un neurone de différenciation, et la la migration tangentielle postmitotique associé dans le EGL intérieure ainsi que l'interrupteur tardà la migration radiale, restent mal compris. Ceci est dans une large mesure en raison de l'intransigeance de l'EGL expérimentale: il est tard en développement et difficiles à cibler génétiquement puisque bon nombre des mêmes molécules neurogènes sont également cruciales tôt dans la vie des précurseurs de granulés à la lèvre rhombique. Pour surmonter ce problème, de nombreux auteurs ont développé in vivo et ex vivo électroporation comme une méthode pour cibler le cervelet postnatale chez les rongeurs ^43-48. Ici, nous Pioneer l'utilisation des ex vivo électroporation dans poussin pour étudier le EGL, ce qui représente des avantages considérables en termes de coût et de commodité. Notre méthode d'électroporation et ex vivo tranche culture de tissu cérébelleux poussin utilise le tissu disséqué jour embryonnaire 14 poussins au sommet de EGL prolifération. Cette méthode permet le ciblage génétique de l'EGL indépendamment de la lèvre rhombique et préparera le terrain pour la dissection génétique de la transition de granuleprogéniteur de neurone post-mitotiques granule dans le cervelet.

Protocol

Remarque: Toutes les expériences ont été réalisées avec conformément au King College de Londres, Royaume-Uni et les lignes directrices de soins aux animaux UK Home Office. 1. Dissection de e14 Cerebellum Incuber les oeufs bruns de poule fertilisés à 38 ° C à jour embryonnaire 14. L'aide de ciseaux d'œufs décapitent embryon de poulet in ovo et retirer la tête d'une boîte de Pétri contenant de la glace froide PBS (figure…

Representative Results

Cette section présente des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant tranche électroporation et la culture du cervelet jour embryonnaire 14 poussin. La dissection du cervelet est illustré sur la Figure 1 et la chambre d'électroporation mis en place est représenté sur la Figure 2. On montre qu'il est possible pour l'électroporation et avec succès la culture des tranches de cervelet, qui conservent leur structure et …

Discussion

Le protocole présenté ici décrit une méthode pour disséquer, électroporation et la culture tranches de jour embryonnaire 14 cervelet du poussin. Ce protocole permet le ciblage de l'électroporation aux petites régions focales de l'EGL, y compris le ciblage isolé de lobes cérébelleux individuels. Il permet l'analyse génétique et de l'imagerie à haute résolution et de commodité, et à un faible coût par rapport à des techniques établies chez les rongeurs ^43-47. Cette analyse es…

Materials

McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.