Экс Vivo культуры Чик мозжечка ломтиками и пространственно Целевые Электропорация ЗК прекурсоров

Summary

Мозжечка внешний слой гранул сайт крупнейшего транзитного усиления в развивающемся мозге. Здесь мы приводим протокол целевой генетической модификации к этому слою на пике распространения с использованием естественных условиях электропорации экс и культуры мозжечка ломтиками из эмбриональных день 14 куриных эмбрионов.

Abstract

Мозжечка внешний слой гранул (EGL) является местом крупнейшей транзитной усиления в развивающемся мозге, и отличная модель для изучения нейронов пролиферации и дифференцировки. Кроме того, эволюционные изменения ее пролиферативной способностью были ответственны за резкого расширения мозжечковой размера в амниот, что делает мозжечок отличная модель для Evo-Devo исследований позвоночных мозг. Учредительные клетки EGL, мозжечка гранул предшественники, также представляют собой значительную ячейку происхождения медуллобластомой, одной из самых распространенных педиатрической нейронов опухоли. После транзитного усиления, гранул прекурсоров мигрировать в радиальном направлении внутренней зернистого слоя мозжечка, где они представляют большой нейронов населения в зрелом мозге млекопитающих. У кур, пик распространения EGL происходит в конце второй недели беременности. В целях выявления генетической модификации к этому слою напик распространения, мы разработали метод для генетических манипуляций через экс естественных условиях электропорации мозжечка ломтиками от эмбриональных день 14 куриных эмбрионов. Этот метод повторяет несколько важных аспектов в естественных развития гранул нейронов и будет полезен в создании полного понимания пролиферации мозжечка гранул и дифференцировки клеток, и, следовательно, развитие мозжечка, эволюции и болезни.

Introduction

Мозжечок расположен у переднего конца заднего мозга и отвечает за интеграцию сенсорной и моторной переработки в зрелом мозге, а также регулирования более высокие когнитивные процессы ^1. У млекопитающих и птиц, это имеет продуманную морфологии и степени расслаивается, продукт обширного транзитной усиления предшественников в процессе разработки, который производит более половины нейронов в мозге взрослого. Мозжечок является предметом изучения для нейробиологов в течение многих столетий и в молекулярной эры также уделено значительное внимание. Это относится не только к его сути интересной биологии, но также в том, что она в значительной степени причастны к болезни человека, включая развития генетических расстройств, таких как расстройства аутистического спектра ^{2 и} наиболее важное мозжечка рака, медуллобластомой ^3, который является наиболее распространенным педиатрических мозга опухоли. Важно отметить, что это отличная модель системы в WHIch изучать распределение судьба и нейрогенез во время развития мозга ^4. В последние годы, он также был создан в качестве модельной системы для сравнительного исследования развития мозга, в связи с огромным разнообразием форм мозжечка видели по позвоночных филогении ^5-10.

Мозжечок развивается из дорсальной половине ромбомера 1 в заднем мозге и развитием ¹¹ состоит из двух основных популяций клеток-предшественников, ромбической губой и вентрикулярной зоне. Ромбической губы простирается вокруг спинного области нейроэпителия заднего мозга на границе с потолочной панели. Это родина глутаматергических возбуждающих нейронов мозжечка ^12-14. Желудочковая зона приводит к тормозных ГАМК нейронов мозжечка, наиболее заметно большие Пуркинье нейронов ^14,15. Позднее в развитии (от примерно 13,5 эмбриональный день у мышей; е6 в куриных ^16), глутаматергической Progenitors мигрировать касательной с ромбической губы и образуют слой мягкой мозговой оболочки клеток-предшественников: зона вторичного предшественников называется внешним гранул слой (EGL). Именно это слой, который подвергается обширной транзитной усиление, что приводит к огромным количеством гранул нейронов, найденных в зрелом мозге.

Распространение в EGL уже давно связан с суб-пиальных месте, что результаты от касательной миграции из ромбической губы ^17, с переходом на выходе клеточного цикла и дифференцировки нейронов предшественников, ассоциированных с их выходом из внешнего слоя EGL в середине EGL ^18. Обширная касательной миграция постмитотических зернистых клеток в медиальной-боковой оси происходит в середине и внутренней EGL ^19, до окончательного радиальной миграции во внутреннюю гранул слоем зрелой коре мозжечка. Миграция клеток из ромбической губы над мозжечка поверхности зависит от CXCL12 сигнализации от Пиа ^20-22 </sup> И ЗК выразить CXCL12 рецептор CXCR4. Их касательной миграция, таким образом, напоминает, что из неокортекса касательной миграции населения ингибирующие интернейронов ^23-25. Интересно, электронные микроскопические исследования ¹⁷ показали, что EGL клетки с пролиферативной морфологии поддерживать контакт мягкой мозговой оболочки, связывая поведение клеток с пролиферативной способности в манере, напоминающей базальных клеток-предшественников в коре млекопитающих ^26. Это нашло свое отражение в вышеупомянутом стратификации EGL в трех подслоев, которые определены различными внеклеточного сред и где гранулы прекурсоров отчетливое выражение гена подписи ^18.

Пролиферация клеток-предшественников в oEGL происходит с нормальным распределением размеров клонов, так что, когда предшественники отдельности генетически помечены в конце эмбрионального развития у мышей, они приводят к срединной среднем 250-500 г постмитотичностиranule нейроны ^27,28. Распространение зависит от митогенной сигнализации SHH от основных Пуркинье нейронов ^29-32. Способность реагировать на SHH было показано, что полностью зависит от клеточного автономной экспрессии фактора транскрипции Atoh1, как в пробирке ³³ и в естественных условиях ^34,35. Кроме того, выход клеточного цикла и дифференциации, как было показано, зависит от экспрессии ниже по потоку фактора транскрипции NeuroD1 ^36, которая, вероятно прямым репрессором Atoh1 ^37.

Несмотря на этот прогресс, и значительный продвижения в расшифровке биологическую основу клеток клеточного цикла выхода ^38-42, фундаментальная молекулярный механизм (ы), которые лежат в основе решения для выхода из клеточного цикла и перехода от предшественника к дифференциации нейрона, и Associated постмитотическими касательной миграции во внутреннем EGL, а также позднее переключательрадиальной миграции, по-прежнему полностью понял. Это в значительной степени из-за экспериментальной труднорешаемости в EGL: это поздно развивается, и трудно целевой генной так как многие из тех же молекул нейрогенных также важны в начале жизни гранул предшественников в ромбической губы. Чтобы преодолеть эту проблему, многие авторы разработали в естественных условиях и экс естественных условиях электропорации как метода целевым послеродовой мозжечка у грызунов ^43-48. Здесь мы пионерами использование экс виво электропорации в куриных изучать EGL, который представляет значительные преимущества с точки зрения стоимости и удобства. Наш метод электропорации и экс естественных среза культуры куриного мозжечка ткани использует ткани рассекают из эмбриональных день 14 цыплят на пике распространения EGL. Этот метод позволяет генетический адресности EGL независимо от ромбической губы и подготовить почву для генетического расчленения перехода от гранулпредшественников в постмитотичности гранул нейрона в мозжечке.

Protocol

Примечание: Все эксперименты проводились с соответствии с Королевского колледжа в Лондоне, Великобритании и руководящих принципов по уходу за животными UK Главная Office. 1. Вскрытие E14 мозжечка Выдержите коричневые оплодотворенной кур яйца на 38 ° С до эмбрионального …

Representative Results

В этом разделе приведены примеры результатов, которые могут быть получены с помощью электропорации ломтик и культуры мозжечка из эмбриональных день 14 кур. Рассечение мозжечка показано на рисунке 1, и электропорации камера установка показана на рису…

Discussion

Протокол сообщил здесь описан способ рассечения, электропорации и культивирование срезов эмбрионального день 14 мозжечка с птенцом. Этот протокол позволяет адресности электропорации малых фокусных регионов EGL, в том числе изолированных адресности отдельных мозжечка лепестков. Это да…

Materials

McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.