Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes

Summary

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Abstract

Um novo método de extracção em fase sólida (SPE) de amostras de água do ambiente é proposto. O protótipo desenvolvido é amigável custo-eficiente e usuário, e permite realizar SPE rápido, automatizado e simples. A solução de pré-concentrado é compatível com a análise por imunoensaio, com um conteúdo de solvente orgânico de baixo. É descrito um método para a extracção e concentração da pré-hormona natural 17β-estradiol em 100 ml de amostras de água. SPE de fase reversa é efectuada com octadecil-sílica adsorvente e a eluição é feita com 200 ul de metanol a 50% v / v. Eluente é diluída por adição de di-água para baixar a quantidade de metanol. Depois de preparar manualmente a coluna SPE, o procedimento geral é realizada automaticamente dentro de 1 hora. No final do processo, a concentração de estradiol é medido usando um ensaio imuno-sorvente comercial ligado a enzima (ELISA). 100 vezes pré-concentração é conseguida e o teor de metanol em apenas 10% v / v. Recuperações de pleno direito da moléculasão alcançados com 1 ng / L amostras adicionadas desionizada e água do mar sintética.

Introduction

A preparação da amostra é uma etapa importante em qualquer processo analítico. Em particular, a remoção dos efeitos de matriz, diminuição das interferências, e enriquecimento da substância a analisar são necessárias para obter resultados precisos e atingem baixos limites de detecção. Compostos de desregulação endócrina (EDC) são particularmente preocupantes devido à sua ação sobre os organismos vivos, mesmo quando presentes em níveis muito baixos no meio ambiente. O hormônio natural 17β-estradiol está presente na poluição da água UE Watch List e propenso a ser adicionado à lista de substâncias prioritárias regulamentados pela Directiva-Quadro da Água da UE. Extracção em fase sólida (SPE), é geralmente utilizado para a análise de pequenas poluentes na água, com tanto química ^1-5 (cromatografia, espectrometria de massa) e métodos de detecção imunológicos ^6-9. Este último ganhou interesse no campo da monitorização ambiental, como imunoensaios estão disponíveis em grande variedade de formatos, são específicas para a TArPegue analito, e atingir baixos limites de detecção. ^{6, 7, 10, 11} Vários ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISA) estão comercialmente disponíveis e permitem analisar várias amostras ao mesmo tempo sobre uma placa multi-poços. O procedimento consiste em passos de reacção sucessivos que podem levar algumas horas. O produto final da reacção pode ser detectado opticamente para determinar a concentração da molécula alvo com base em uma curva de calibração.

SPE procedimentos clássicos incluem sorvente pré-condicionado, extracção da amostra, a lavagem, a eluição, e concentração por evaporação do eluente. O solvente utilizado para a diluição deste extracto é escolhido dependendo do método de detecção. ¹² Para os métodos imunológicos, a quantidade de solvente orgânico influências fortemente a sensibilidade do método.

Para além da recuperação e os desempenhos de pré-concentração, o método também tem de ser simples e de custo eficiente. Automação do Procedure ajuda a reduzir erros humanos-relacionados. No nosso trabalho anterior ¹³ que introduzida a protótipo para SPE automatizado, e o nosso método foi aplicado para a análise da hormona natural 17β-estradiol nas amostras de água do mar. Com o presente vídeo, gostaríamos de destacar as vantagens técnicas do nosso método em comparação com off-line tradicional e on-line SPE, e em particular a sua compatibilidade com detecção por imuno-reacções. Nós descrevemos o protocolo aplicado a amostras de água para a detecção de 17β-estradiol. SPE é realizada com octadecil-silica (C18) de fase sorvente e a eluição é realizada com metanol diluído.

Protocol

Nota: O protocolo seguinte descreve a SPE realizada em amostra de 100 ml de água com sorvente C18 e eluição com 50% v / v de metanol. A amostra é diluída enriquecido para chegar a 10% v / v de metanol, antes da análise com um ensaio de imunoabsorção enzimática kit (ELISA). 1. Preparar os reagentes Prepare as amostras de água Antes de qualquer outra etapa, filtrar cada amostra de 100 ml de água com filtros de tamanho de poro de 0,2 um. Pico a amostra c…

Representative Results

A reprodutibilidade da embalagem sorvente foi avaliada por secagem e pesagem do sorvente pipetado em frascos de vidro e o resultado é mostrado na Figura 1. A reprodutibilidade do tempo de injecção foi testado para as amostras de 100 ml, como mostrado na Figura 2. A concentração in inicial e pré- concentrado cravado amostras foram determinadas usando um kit comercial de ELISA para 17β-estradiol e são mostrados <st…

Discussion

Foi proposto um novo método para a preparação de amostras de água seguida por análise utilizando imunoensaio. O instrumento permite realizar extração em fase sólida de forma automatizada e fácil de usar.

A filtração da amostra de água antes da sua injecção no sistema é crítico. Quaisquer partículas ainda presentes na solução seria, potencialmente, causar o entupimento da rede de fluidos e obstruir a coluna de SPE. Outro passo importante é a preparação da coluna de SPE. …

Materials

Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm particle diameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, range 30 – 3000 ng/L