Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Summary

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Abstract

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.

To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.

Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

Introduction

Engenharia de tecido cardíaco avançou muito na última década, com vários grupos editoriais resultados de tecidos totalmente funcionais, batendo feitos a partir de ambos os cardiomiócitos murinos ^1-6 e, mais recentemente, derivadas de células-tronco miócitos cardíacos humanos ^7-12. O campo de engenharia de tecido cardíaco é impulsionado por dois objetivos primários e essencialmente independentes: 1) para desenvolver enxertos exógenos que podem ser transplantados para não corações para melhorar a função ^4-6; e 2) para desenvolver modelos in vitro para estudo da fisiologia e da doença, ou como ferramentas de rastreio para o desenvolvimento terapêutico ^2,7.

Tridimensional de cultura de células (3-D) é considerado essencial para o desenvolvimento de ferramentas de rastreio da próxima geração, como a matriz 3-D reflecte um microambiente cardíaca mais natural do que a cultura de células em monocamada de 2-D tradicional; na verdade, alguns aspectos da biologia celular são fundamentalmente diferentes em 2-D culturas vs. 3-D ^13,14 </sup>. Além disso, os tecidos cardíacos modificadas são construídas a partir de componentes completamente definidas: uma matriz extracelular, e uma população de células. Para tecidos cardíacos humanos modificados tradicionais, enquanto a composição da matriz extracelular (geralmente fibrina ⁹ ou colagénio ^7,8,10) é rigorosamente controlada, a composição celular de entrada é menos bem definido, com toda a mistura de células a partir de uma diferenciação cardíaca dirigido de qualquer das as células estaminais embrionárias (ESC ^7,9) ou células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC ^10,12) sendo adicionado aos tecidos. Dependendo da linha celular específica e a eficiência da diferenciação protocolo usado, a percentagem de cardiomiócitos resultante pode variar de menos do que 25% a mais de 90%, o fenótipo de cardiomiócitos específica (isto é, ventricular-, atrial-, ou pacemaker-like) também pode variar, mesmo a fracção não cardiomiócitos pode ser altamente heterogénea ^15,16 e alterar a maturidade do diferenciada m cardíacayocytes ^17.

Trabalhos recentes em engenharia de tecidos cardíaco tem tentado controlar a população de células de entrada, quer com uma superfície repórter cardíaca linha de células estaminais embrionárias humanas, ou células ⁸ marcadores de ¹⁸ a ser usado para isolar o componente miócitos cardíacos da diferenciação. Embora inicialmente um tecido composto por apenas miócitos cardíacos parece ser o ideal, este não é de facto o caso; hects compostas unicamente de miócitos cardíacos deixar de compactar em tecidos funcionais, com alguns grupos encontrar uma proporção de 3: 1 de miócitos cardíacos: fibroblastos que produzem a maior força de contração ^8. Usando vários métodos de seleção de células, incluindo marcadores de superfície para triagem de células vivas, é possível criar hects com populações de células definidas. Enquanto que os marcadores de células estromais não cardíacas têm estado disponíveis durante algum tempo, tal como o marcador de fibroblastos putativo CD90 ^19,20, marcadores de superfície de miócitos cardíacos foram mais difícilpara identificar. SIRPα foi um dos primeiros marcadores de superfície cardíacas identificados para os miócitos cardíacos humanos ¹⁸ e foi mostrado ser altamente selectiva para a linhagem cardíaca. Recentemente, descobrimos que double-ordenação para SIRPα ⁺ e CD90 ^– células produz cardiomiócitos quase puros, com o CD90 ⁺ população exibindo um fenótipo de fibroblastos-like (Josowitz, observações não publicadas). Com base nestes resultados coletados, aqui nós descrevem a criação hects usando um 3: Combinação 1 de SIRPα ⁺ / CD90 ^– cardiomiócitos e CD90 ⁺ fibroblastos.

A capacidade de projetar um tecido cardíaco humano completamente definida é essencial não só para a criação de ferramentas de rastreio robustas, mas também para o desenvolvimento de sistemas de modelo para investigar cell- emergentes e terapias cardíacas baseadas em genes. Em particular, as numerosas terapias celulares para a insuficiência cardíaca, utilizando tipos de células, incluindo células-tronco mesenquimais (MSC) ²¹ </sup>, as células estaminais e células cardíacas ²² mononucleares de medula óssea ^23-25, foram testados em ensaios clínicos. Embora muitos dos resultados iniciais têm sido promissores ^21,23,25, o benefício inicial, muitas vezes diminui ao longo do tempo ^26-29. Uma tendência semelhante foi relatado em murino engenharia tecidos cardíacos, que apresentam um benefício funcional significativa, devido à suplementação MSC, mas o benefício não é sustentada durante a cultura de longo prazo ^1. Subjacente ao desempenho abaixo do ideal é o nosso conhecimento limitado dos mecanismos que regem as terapias celulares. Uma compreensão mais profunda de como as células terapêutica exercer a sua influência benéfica, bem como potenciais consequências negativas das interações miócitos-nonmyocyte, permitiria o desenvolvimento de terapias melhoradas produzindo benefícios clinicamente significativa e sustentada, com efeitos colaterais mínimos, para pacientes com insuficiência cardíaca.

Aqui, descrevemos o uso de hects definidos para interrogComeram mecanismos da terapia à base de células. A composição do tecido controlada é essencial para identificar os fatores específicos que afetam o desempenho dos cardiomiócitos. Diretamente completando hects com o tipo de célula terapêutica de interesse (por exemplo, MSCs), pode revelar os efeitos sobre o desempenho dos miócitos cardíacos, como já demonstrado em ECTs de ratos ^1.

O seguinte protocolo multi-passo começa com a diferenciação de células estaminais cardíaca dirigida, seguida de fabricação do bioreactor multi-tecido, e concluindo com uma descrição da construção do tecido e análise funcional. Nossos experimentos são realizados utilizando a linha de células estaminais embrionárias humanas NIH-aprovado H7 (hESC). No entanto, os protocolos seguintes também foram testados utilizando uma linha de células estaminais embrionárias humanas adicionais e três linhas de células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSC) com resultados semelhantes. Verificou-se que a eficiência na diferenciação de cardiomiócitos e sucesso no HECT fabricação pode ser dependente de células de linha, especialmente folinhas r hiPSC derivadas de pacientes individuais. Seguindo este protocolo, os dois pratos de 6 poços foram semeadas com um total de 1,68 milhões de hESCs (140.000 células por poço), que produz cerca de 2,5 milhões de miócitos depois diferenciar durante 20 dias e separação, o suficiente para fazer seis tecidos definidos.

Protocol

Nota: executar todas as manipulações de células em condições assépticas, usando uma câmara de segurança biológica filtrado HEPA-classe II e esterilizar todas as soluções, filtrando-os através de um filtro de 0,2 um. Realizar a construção de tecido e teste de função quer nas mesmas condições assépticas ou uma câmara de fluxo laminar. 1. Plantio de H7 hESCs em Preparação para Diferenciação Cardíaca (Dia 1) Preparação da membrana basal Matrix Desco…

Representative Results

Para obter miócitos cardíacos, uma versão ligeiramente modificada dos métodos de diferenciação Boheler e Lian é usado 30,31. É imperativo que a diferenciação começa durante a fase log-do crescimento das células, mas também que a população inicial é suficientemente confluentes para obter um número de células utilizável, após separação (cerca de 75% é óptimo). Tipicamente, para H7 hESCs, plaqueamento a uma densidade de 140.000 hESCs por poço de um prato de 6 poços no essencial 8 media …

Discussion

Construção de tecidos humanos definidos engenharia cardíacas (Hect) pode fornecer um modelo mais consistente e confiável da função dos miócitos cardíacos humano. Fundamentalmente, todos os componentes celulares e extracelulares no sistema são conhecidos e podem ser manipuladas como desejado, removendo assim a confusão influência de outros tipos celulares desconhecidos resultantes do processo de diferenciação. Para equilibrar o crescimento celular rápido e elevado rendimento, é preferível que a diferencia…

Materials

Cell Culture	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize
B27 with Insulin	Life Technologies	17505055
B27 without Insulin	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Human Embryonic Stem Cells	WiCell	WA07
hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel	Corning	354277	Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C
Neonatal Calf Serum	Life Technologies	16010159
Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Keep refrigerated
Y-27632 (ROCK Inhibitor)	Stemgent	04-0012	Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C.  Avoid freeze thaw cycles.
Cell Sorting	Company	Catalog Number	Comments
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution)	PromoCell	C-41200
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Tissue Construction	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Optional: For collection of supplemental cells of interest
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10X PBS Packets	Sigma-Aldrich	P3813
Collagen, Bovine Type I	Life Technologies	A10644-01	Keep on ice
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose	Sigma-Aldrich	D5648
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352096
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Corning	352235	With integrated 35 μm cell strainer
50 ml polyproylene centrifuge tube	Corning	352070
6-well flat bottom tissue-culture treated plate	Corning	353046
Cell Scraper, Disposable	Biologix	70-2180
Polysulfone	McMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Olympus	SZ-61	Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach
Electrical Pacing System	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimulator
High Speed Camera	Pixelink	PL-B741U	Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition
Plate Temperature Control			Used to maintain media temperature during data acqusition.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			available upon request from the authors