De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy
Summary
This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Abstract
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Introduction
Cardiale tissue engineering is sterk gevorderd in de afgelopen tien jaar, met meerdere groepen publiceren van resultaten van volledig functioneel, het verslaan van weefsels, vervaardigd van zowel muizen hartspiercellen 1-6 en, meer recentelijk, menselijke stamcel-afgeleide cardiomyocyten 7-12. Het hartweefsel vakgebied dat wordt aangedreven door twee primaire en wezen onafhankelijk doelen: 1) om exogene transplantaten die kunnen worden getransplanteerd in falende harten functioneren 4-6 verbeterd; en 2) de ontwikkeling in vitro modellen voor het bestuderen van de fysiologie en ziekte, of screeningsmethoden voor therapeutische ontwikkeling 2,7.
Drie-dimensionale (3-D) celkweek is essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe generatie screeningsmethoden, als de 3-D matrix geeft een natuurlijker cardiale micro dan traditionele 2-D monolaag celcultuur beschouwd; inderdaad een aantal aspecten van celbiologie totaal andere 2-D versus 3-D kweken 13,14 </sup>. Bovendien zijn ontworpen hartweefsel opgebouwd uit volledig gedefinieerde componenten: een extracellulaire matrix, en een celpopulatie. Voor traditionele gemanipuleerde menselijke cardiale weefsels, terwijl de extracellulaire matrix samenstelling (gewoonlijk fibrine 9 of collageen 7,8,10) streng wordt gecontroleerd, de invoercel samenstelling minder goed gedefinieerd, door het hele mengsel van cellen van een gerichte cardiale differentiatie van beide embryonale stamcellen (ESC 7,9) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC 10,12) worden toegevoegd aan de weefsels. Afhankelijk van de specifieke cellijn en de efficiëntie van de differentiatie protocol, kan de resulterende percentage hartspiercellen variëren van minder dan 25% tot meer dan 90%, de specifieke hartspierfenotype (dwz ventricular-, atriaal of gangmaker-achtig) kan ook variëren, zelfs de niet-cardiomyocyt fractie kan zeer heterogeen 15,16 en de looptijd van de gedifferentieerde cardiale m veranderenyocytes 17.
Recente hartweefsel engineering heeft getracht de ingang celpopulatie controleren, met ofwel een cardiale reporter humane embryonale stamcellijn 8 of celoppervlak markers 18 wordt gebruikt om de hartspiercel component van de differentiatie isoleren. Hoewel aanvankelijk een weefsel uit slechts cardiomyocyten lijkt het ideaal zijn, is dit in feite niet het geval; hECTs uitsluitend uit cardiomyocyten niet comprimeren tot functionele weefsels met bepaalde groepen vinden van een 3: 1 verhouding van cardiale myocyten: fibroblasten die de hoogste twitch kracht 8. Via verschillende celselectie methoden, waaronder oppervlakte merkers voor levende celsortering, kan men hECTs met gedefinieerde celpopulaties maken. Terwijl markers van niet-cardiale stromacellen enige tijd beschikbaar CD90 19,20 zijn, zoals de vermeende fibroblast marker zijn oppervlaktemerkers van cardiale myocyten moeilijker geweestte identificeren. SIRPα was een van de eerste cardiale oppervlakte merkers geïdentificeerd voor menselijke cardiale myocyten 18 en blijkt zeer selectief voor de cardiale lijn zijn. Onlangs hebben we gevonden dat dubbel met gescheiden SIRPα + en CD90 – cellen geeft nagenoeg zuiver cardiomyocyten met de CD90 + populatie vertoont een fibroblast-achtige fenotype (Josowitz, ongepubliceerde waarnemingen). Op basis van deze bevindingen verzameld, hierin beschrijven we creëren hECTs met een 3: 1 combinatie SIRPα + / CD90 – CD90 + cardiomyocyten en fibroblasten.
De mogelijkheid om een volledig gedefinieerd menselijk hartweefsel ingenieur is niet alleen essentieel voor het creëren van robuuste screening instrumenten, maar ook voor het ontwikkelen van modellen voor opkomende cel- en gen-gebaseerde cardiale therapieën te onderzoeken. Vooral veel celtherapie voor hartfalen, gebruik celtypen waaronder mesenchymale stamcellen (MSC) 21 </sup>, cardiale stamcellen 22 en beenmerg mononucleaire cellen 23-25, getest in klinische studies. Hoewel veel van de eerste resultaten zijn veelbelovend 21,23,25, de aanvankelijke voordeel vermindert vaak tijd 26-29. Een soortgelijke trend is gemeld bij muizen gemanipuleerde cardiale weefsels, die een belangrijke functionele voordelen te geven als gevolg van MSC suppletie, maar het voordeel is bij langdurige cultuur 1 niet volgehouden. Grondslag liggen aan de sub-optimale prestaties is onze beperkte kennis van de mechanismen die celtherapie. Een dieper begrip van hoe therapeutische cellen hun gunstige invloed, alsmede mogelijke negatieve gevolgen van myocyten-nonmyocyte interacties uit te oefenen, zou de ontwikkeling van verbeterde therapieën waardoor klinisch significante en blijvende voordelen, met minimale bijwerkingen voor patiënten met hartfalen mogelijk te maken.
Hier beschrijven we het gebruik van gedefinieerde hECTs te interrogat mechanismen van cel-gebaseerde therapie. De gecontroleerde weefsel samenstelling is van essentieel belang om specifieke factoren die van invloed zijn cardiomyocyt prestaties te identificeren. Direct vullen hECTs de therapeutische celtype van belang (bijvoorbeeld MSC), kunnen de effecten op de cardiale myocyten prestaties onthullen, zoals we in ratten ECT 1 aangetoond.
De volgende meerdere stappen protocol begint met gerichte cardiale stamcel differentiatie, gevolgd door de vervaardiging van de multi-weefsel bioreactor, en afgesloten met een beschrijving van weefsel constructie en functionele analyse. Onze experimenten worden uitgevoerd met behulp van de NIH-goedgekeurde H7 menselijke embryonale stamcellen (hESC) lijn. Echter, de volgende protocollen ook getest met behulp van een extra hESC lijn en drie geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) lijnen met vergelijkbare resultaten. Wij hebben gevonden dat de efficiëntie bij cardiomyocyt differentiatie en succes in Hect fabricage afhankelijke cellijn kan zijn, met name for iPSC lijnen afgeleid van individuele patiënten. Door dit protocol worden twee 6 putjes bedekt met in totaal 1.680.000 hESCs (140.000 cellen per putje), die ongeveer 2,5 miljoen myocyten na differentiatie gedurende 20 dagen en sorteren, genoeg om zes gedefinieerde tissues oplevert.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bouw van gedefinieerde menselijke gemanipuleerde cardiale weefsels (hect) kan een meer consistente en betrouwbare model van menselijke hartspiercel functie te geven. Kritisch, alle cellulaire en extracellulaire componenten in het systeem bekend en kunnen als gewenst, waardoor de verstorende invloed van andere onbekende celtypen gevolg van het differentiatieproces verwijderd worden gemanipuleerd. Snelle celgroei en hoge opbrengst evenwicht heeft het de voorkeur dat de differentiatie begint bij 75% samenvloeiing van de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH (1F30HL118923-01A1) aan TJC, NIH / NHLBI PEN contract HHSN268201000045C aan KDC, de onderzoeksbeurs Raad van Hong Kong TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) naar BDG, de Amerikaanse Heart Association (12PRE12060254) naar RJ en Research Grant Raad van HKSAR (TBR's, T13-706 / 11) Aanvullende financiering RL werd door de NIH DRB 5T32GM008553-18 en als een stage op NIDCR-Interdisciplinair Training in systemen en Ontwikkelingspsychologie aan TJC voorzien biologie en geboorteafwijkingen T32HD075735. De auteurs willen ook dankbaar erkennen Arthur Autz op de Zahn Centrum van het City College of New York voor hulp bij het bewerken van de bioreactor en Mamdouh Eldaly voor technische ondersteuning. We danken ook Dr. Kenneth Boheler voor advies over cardiale differentiatie en Dr. Joshua Hare voor royaal verstrekken van menselijke mesenchymale stamcellen.
Materials
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
Riferimenti
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
- Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
- Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, 16-23 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
- Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
- Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
- Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial–a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months’ follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
- Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
- Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
- Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
- Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
- Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
